Ottenimento di una coltura di cellule gliali miste da un cervello di topo neonatale

Abstract

Fonte: Sarkar, S. et al., Isolamento magnetico CD11b rapido e raffinato di microglia primarie con purezza e versatilità migliorate. (2017)

Il video ha dimostrato il metodo di isolamento e coltura delle cellule dal cervello di un topo neonatale. Ha comportato la dissociazione enzimatica e meccanica del cervello, seguita dalla coltura in terreni di crescita privi di fattore di crescita neuronale per ottenere una popolazione gliale mista.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Coltivazione di colture gliali miste

1. Decapitare rapidamente i cuccioli di 1-2 giorni con forbici da 5,5 pollici e posizionare immediatamente le teste in una provetta da 50 ml sul ghiaccio. Si noti che questa decapitazione è la modalità di eutanasia.
2. In un cappuccio a flusso d'aria laminare, praticare una piccola incisione nel cranio e nelle meningi utilizzando forbici da micro-dissezione diritte da 4,5 pollici. Iniziare a tagliare dall'estremità caudale all'estremità rostrale (naso). Entra sotto la pelle usando l'apertura formata dalla decapitazione.
   1. Dopo l'incisione, sbucciare lateralmente una delle semisfere. Quindi usa un paio di pinzette curve o uncinate per rimuovere l'intero cervello.
3. Immergere il cervello in una nuova provetta da 50 ml contenente lo 0,25% di tripsin-etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 °C. Utilizzare 2 ml di tripsina-EDTA per cervello.
4. Lavare il cervello (10% di siero fetale bovino (FBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient mixture F12 (DMEM/F12), 1% penicillina/streptomicina, 1% L-glutammina, 1% piruvato di sodio e 1% aminoacidi non essenziali) aggiungendo e rimuovendo il terreno. Ripeti l'operazione 4 volte.
5. Per ogni cervello, piastrate due fiasche T-75 contenenti terreni di coltura. Pertanto, aggiungere 2 ml di terreno di coltura per cervello alla provetta. Pertanto, sarà un equivalente di 1 mL di cervello omogeneizzato con 8-9 mL di terreno di crescita per pallone T-75.
6. Omogeneizzare triturando il cervello (o i cervelli) con pipette di diverse dimensioni di apertura, in ordine dal più grande al più piccolo. Quando è visibile che il tessuto cerebrale non sta diventando più piccolo, passare alla pipetta successiva. Al termine della triturazione, la sospensione deve essere chiara, senza pezzi visibili.
   1. Utilizzare una pipetta da 25 ml, una pipetta da 5 ml e quindi una pipetta da 10 ml in sequenza.
7. Far passare ogni sospensione cerebrale omogenea attraverso un filtro cellulare da 70 μm per trasformarla in una singola coltura cellulare.
8. Per ogni cervello omogeneizzato, impiattare due fiasche di T-75 contenenti terreni di crescita, come descritto al punto 1.5 (1 mL di cervello omogeneizzato con 8-9 mL di terreno di crescita per pallone di T-75).
9. Cambiare il terreno di crescita dopo 6 giorni e crescere fino all'isolamento il 16^° giorno.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Tecnologie per la vita	11330057
Piruvato di sodio	Tecnologie per la vita	11360070
MEM Aminoacidi non essenziali (100x)	Tecnologie per la vita	11140050
L-Glutammina (100x)	Tecnologie per la vita	25030081
Edta	Fisher Scientifico	AM9260G
Siero fetale bovino	sigma	13H469
0,25% tripsina-EDTA	Gibco di Life Technologies	Codice 25200