Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in cellule simili alla microglia

Abstract

Fonte: Funes, S. et al., Cellule simili alla microglia umana: Differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi su cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani.J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra la procedura di differenziazione delle cellule pluripotenti umane in cellule simili alla microglia. Il processo prevede la formazione di corpi embrioidi, il loro trasferimento in pozzetti rivestiti e l'utilizzo di fattori di crescita specifici per guidare la differenziazione in precursori primitivi dei macrofagi, che infine si differenziano in cellule simili alla microglia.

Protocollo

1. Differenziazione delle microglia

NOTA: Una panoramica del protocollo è riassunta nella Figura 1.

1. Coltura di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)
   nota: Ulteriori dettagli che descrivono le tecniche di coltura delle iPSC possono essere trovati altrove.
   1. Scongelamento e manutenzione
      1. Preparare il terreno iPSC, aliquotarlo e conservarlo a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Scongelare le aliquote per una notte a 4 °C e utilizzarle per un massimo di 1 settimana. Lasciare il fluido a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.
      2. Rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti aggiungendo 1 mL di 10 μg/mL di laminina 521 diluita in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) contenente calcio e magnesio. Conservare le piastre in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂ per almeno 2 ore o preferibilmente durante la notte. Una volta diluita, conservare la laminina a 4 °C per 3 mesi.
      3. Preparare 10 mM di soluzione madre di inibitore della Rho chinasi Y27632 (ROCK Inhibitor) diluendo in acqua sterile. Preparare aliquote monouso della soluzione inibitrice di ROCK e conservarle a -20 °C per un massimo di 1 anno.
      4. Preparare 0,5 mM di acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) diluendo la soluzione madre di 0,5 M di EDTA in DPBS.
      5. Per scongelare una fiala di iPSC congelate, mettere la fiala in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando non è quasi scongelata. Trasferire immediatamente il contenuto del flaconcino in una provetta conica da 15 mL contenente 4 mL di terreno iPSC. Centrifugare a 500 × g per 1 min.
      6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo lentamente 1 mL di terreno iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK contro la parete della provetta per evitare di disturbare le colonie.
      7. Aggiungere 1,5 mL di terreno iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK a ciascuno dei pozzetti rivestiti e trasferire le colonie risospese goccia a goccia nei pozzetti contenenti il terreno.
         nota: Utilizzare 5-7 gocce dal passaggio 1.1.1.6 per il mantenimento della coltura, ma regolare la densità di semina ottimale per ogni linea iPSC.
      8. Distribuire uniformemente le cellule nei pozzetti mescolando manualmente la piastra da un lato all'altro e da dietro in avanti. Porre le cellule in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂. Il giorno successivo, sostituire completamente il terreno aggiungendo un terreno iPSC fresco senza inibitore ROCK.
      9. Per il mantenimento, cambiare il terreno ogni giorno fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.
         nota: Le cellule possono essere mantenute senza cambiare il terreno per 2 giorni se il terreno iPSC utilizzato consente un programma di alimentazione flessibile. Si consiglia di limitare questo limite a una volta per passaggio e solo se le celle sono confluenti inferiori al 50%.
   2. emicranico
      1. Aspirare il terreno e lavare le cellule con 1 mL di DPBS (senza calcio e magnesio).
      2. Per rimuovere le cellule, aggiungere 1 mL di EDTA 0,5 mM e incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente fino a quando i bordi delle colonie cellulari non si sollevano dalla superficie del pozzetto. Lavare nuovamente le cellule con DPBS e aggiungere 1 mL di terreno iPSC.
      3. Dissociare le colonie cellulari raschiandole delicatamente con un sollevatore cellulare. Raschiare ogni area del pozzo solo una volta per evitare di disturbare le colonie.
         nota: Metodi alternativi per rimuovere le colonie dal pozzo possono essere trovati altrove.
      4. Utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL, raccogliere le cellule e trasferirle goccia a goccia in un rapporto 1:6 (cellule/terreno) in pozzetti prerivestiti (come indicato al punto 1.1.1.2) contenenti 1,5 mL di terreno iPSC.

2. Differenziazione delle iPSC in cellule simili alla microglia (iMG)

NOTA: Le piccole molecole e i fattori di crescita sono disciolti in albumina sierica bovina filtrata sterile allo 0,1% in DPBS fino a una concentrazione di riserva 1.000 volte superiore alla concentrazione finale. Si raccomanda di differenziare le iPSC in iMG durante i primi passaggi. Si consiglia la cariotipizzazione di routine delle linee iPSC.

1. Preparare una soluzione di rivestimento standard
   1. Scongelare la soluzione madre di un reagente di rivestimento a matrice extracellulare su ghiaccio a 4 °C per una notte.
   2. Preraffreddare le provette per microcentrifuga e filtrare i puntali delle pipette a 4 °C.
   3. Aliquotare 250 μl del reagente concentrato di rivestimento della matrice extracellulare in ciascuna provetta e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio. Conservare le aliquote a -20 °C.
   4. Per preparare la soluzione di rivestimento, scongelare una delle aliquote del reagente di rivestimento della matrice extracellulare su ghiaccio a 4 °C per una notte.
   5. Aggiungere 50 ml di miscela Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient F12 (DMEM-F12) ghiacciata ottimizzata per la crescita di cellule staminali embrionali umane e cellule staminali pluripotenti indotte (denominate DMEM-F12) in una provetta conica preraffreddata e mantenerla in ghiaccio.
   6. Raffreddare un puntale per pipetta da 1 mL pipettando più volte il DMEM-F12 ghiacciato su e giù, quindi utilizzare immediatamente il puntale della pipetta per trasferire 250 μL del reagente di rivestimento della matrice extracellulare nella provetta conica contenente il terreno DMEM-F12.
      nota: La soluzione di rivestimento standard può essere conservata per 2 settimane a 4 °C.
2. Formazione di corpi embrioidi (EB)
   1. Preparare un terreno EB che può essere mantenuto a 4 °C per un massimo di 4 giorni.
   2. Una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, dissociare le colonie lavandole con 1 mL di DPBS e aggiungendo 1 mL di un reagente di dissociazione per 2 minuti a 37 °C. Spostare le colonie utilizzando un sollevatore di cellule raschiando più volte per creare una sospensione a cellula singola. Raccogliere le cellule e trasferire il tutto in una provetta conica da 15 mL contenente 9 mL di DPBS.
   3. Centrifugare le cellule a 500 × g per 1 minuto, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno EB. Prelevare 10 μL di cellule e diluire 1:1 con blu di tripano. Contare le cellule con un ematocitometro e, in base alla conta cellulare, diluire lo stock cellulare fino a una diluizione finale di 10.000 cellule per 100 μl. Per le celle di placcatura, aggiungere 100 μl di celle diluite per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti, a fondo tondo, a bassa aderenza.
      nota: Generalmente, 48 pozzetti della piastra a 96 pozzetti possono essere ottenuti da ogni pozzetto confluente all'80% di iPSC.
   4. Centrifugare la piastra a 125 × g per 3 minuti e incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 4 giorni. Eseguire un cambio semi-terreno il giorno 2 utilizzando una pipetta multicanale e raccogliendo delicatamente 50 μl di terreno vecchio, quindi aggiungendo nuovamente 50 μl di terreno EB fresco.
      nota: Il giorno 4, le iPSC formeranno strutture cellulari sferiche denominate EB, come descritto nella sezione dei risultati. Il processo di differenziazione EB può essere esteso fino a 7 giorni, se necessario.
3. Generazione di precursori primitivi dei macrofagi (PMP)
   1. Preparare il terreno di base PMP, il filtro sterile e conservarlo a 4 °C per un massimo di 1 mese.
   2. Rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti aggiungendo 1 mL di soluzione di rivestimento Matrigel ghiacciata e incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per almeno 2 ore o preferibilmente durante la notte.
   3. Il giorno 4 di differenziazione degli EB, trasferire gli EB nei pozzetti rivestiti di Matrigel raccogliendo gli EB con puntali per pipette da 1 mL (utilizzando una pipetta). Pipettare su e giù una o due volte per rimuovere gli EB dal pozzo. Tenere la piastra a 6 pozzetti con un angolo inclinato per consentire agli EB di depositarsi sul bordo del pozzetto.
      nota: È possibile placcare nove o dieci EB per pozzetto rivestito.
   4. Una volta che tutti gli EB si sono depositati, pipettare delicatamente e rimuovere il vecchio terreno utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL, mantenendo gli EB sul bordo del pozzetto. Aggiungere 3 mL di terreno completo PMP appena preparato a ciascun pozzetto. Distribuire uniformemente le cellule nei pozzetti mescolando manualmente la piastra da un lato all'altro e da dietro in avanti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂.
   5. Non disturbare la piastra per 7 giorni per consentire agli EB di attaccarsi al fondo del pozzetto. Trascorso questo tempo, eseguire un cambio semi-medio utilizzando il mezzo completo PMP.
      nota: A questo punto, la maggior parte degli EB dovrebbe essere attaccata alla piastra. Tutti gli EB fluttuanti possono essere rimossi.
   6. Dopo 5-7 giorni, ispezionare gli EB al microscopio a campo luminoso con un ingrandimento di 4x per assicurarsi che siano attaccati al fondo dei pozzetti. Cambiare il supporto come descritto in 1.2.3.5. Il giorno 21, eseguire un cambio completo del terreno con 3 mL di PMP Complete Medium.
      nota: A questo punto possono essere evidenti i progenitori mieloidi che fluttuano nel mezzo. Queste celle devono essere scartate durante il cambio del terreno.
   7. Il giorno 28, cercare le cellule rotonde denominate PMP nel surnatante e raccogliere il terreno contenente le PMP utilizzando una pipetta da 10 ml e un pipettatore automatico. Fare attenzione a non disturbare gli EB. Trasferire i PMP e il terreno in una provetta conica da 15 mL e procedere come descritto al punto 1.2.4.
      nota: Di solito i PMP della stessa linea iPSC possono essere raccolti da cinque pozzetti di una piastra a 6 pozzetti e raggruppati insieme in un'unica provetta conica da 15 mL.
   8. Aggiungere 3 mL di terreno completo PMP fresco per un'ulteriore manutenzione degli EB. Poiché i PMP emergono continuamente dagli EB per più di 3 mesi, raccoglierli ogni 4-7 giorni (non lasciare che il mezzo cambi colore in un tono giallo) come descritto nei passaggi 1.2.3.7 e 1.2.3.8.
      nota: Sebbene i PMP possano essere raccolti per diversi mesi, possono cambiare il loro fenotipo nel tempo.
4. Differenziazione in iMG
   1. Preparare il terreno base iMG (Tabella dei materiali), filtrare sterile e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
   2. Una volta che i PMP sono stati raccolti in una provetta conica da 15 mL, centrifugarli a 200 × g per 4 min. Aspirare il surnatante e risospendere i PMP utilizzando 1-2 mL di terreno basale iMG. Contare le cellule utilizzando un emocitometro prelevando una piccola aliquota e diluendo 1:1 con Trypan blue.
      NOTA: 0,5-1,5 × 10⁶ PMP si ottengono normalmente ogni settimana a seconda della linea iPSC e dell'età della coltura EB.
   3. Centrifugare nuovamente il resto delle cellule a 200 × g per 4 minuti. Diluire i PMP alla concentrazione desiderata in modo tale che le cellule siano piastrate a una densità di ~10⁵/cm² su piastre trattate con coltura cellulare utilizzando un terreno completo iMG appena preparato. Eseguire un cambio semi-medio utilizzando il terreno completo iMG appena preparato ogni 3-4 giorni per 10-12 giorni per consentire la differenziazione terminale.
      nota: A questo punto, le cellule dovrebbero acquisire una morfologia simile alla microglia. Per confermare l'impegno delle PMP nel destino delle microglia, viene eseguita un'analisi di immunofluorescenza per corroborare l'espressione di marcatori arricchiti di microglia come il recettore purinergico P2RY12 e la proteina transmembrana 119 (TMEM119).
   4. Per preservare la salute e la vitalità delle cellule, eseguire tutti gli esperimenti tra i giorni 10 e 12 di differenziazione di iMG.

Risultati

Figura 1: Schema del protocollo per differenziare le iPSC in cellule simili alle microglia.Il giorno 0, una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, le colonie vengono dissociate in singole cellule e coltivate in terreno EB per indurre la formazione di EB. Il giorno 4, gli EB vengono raccolti e placcati in mezzo PMP per indurre la generazione di PMP. Dopo 28 giorni, i PMP vengono rac...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali per colture cellulari
Piastre a 6 pozzetti	Greiner Bio-One	Codice 657160
100 mm x 20 mm Coltura tissutale trattata	CELLTREAT	Codice 229620
Sollevatore di celle, doppia estremità, lama piatta e lama stretta, sterile	CELLTREAT	229305
Piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a bassa aderenza	Corning	7007
Primaria Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti a fondo piatto modificata con superficie modificata	Corning	353847,
Primaria Piastra di coltura a 6 pozzetti a fondo piatto trasparente a fondo piatto con superficie modificata	Corning	353846
Micropiastra Primaria a fondo piatto trasparente a 96 pozzetti	Corning	353872
Reagenti per dissociazione cellulare
Accutase	Corning	25058CI	Reagenti di dissociazione utilizzati per la differenziazione inferiore dei motoneuroni
Reagente TrypLE	Tecnologie per la vita	12-605-010	Reagenti di dissociazione utilizzati per la differenziazione della microglia
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
Reagenti di rivestimento per colture cellulari
Matrice a membrana Matrigel GFR	Corning™	Codice 354230	Riferito come reagente di rivestimento della matrice extracellulare
CellAdhere Laminina-521	Tecnologia STEMCELL	Codice: 77004	Riferito alla laminina 521
Poli-D-lisina	sigma	P7405	Ricostituire a 0,1 mg/mL in tampone borato
Poli-L-Ornitina	sigma	P3655	Ricostituire a 1 mg/mL in tampone borato
Componenti dei supporti iPSC
Kit mTeSR Plus	Tecnologia STEMCELL	Codice 100-0276	Per preparare i terreni iPSC, mescolare i componenti a 1x
Componenti dei media EB
BMP-4	Fisher Scientifico	PHC9534	Concentrazione finale 50 ng/mL
Supporti iPSC			Concentrazione finale 1x
Inibitore ROCK Y27632	Fisher Scientifico	BD 562822	Concentrazione finale 10 μM
Scf	PeproTech	300-07	Concentrazione finale 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	Concentrazione finale 50 ng/mL
Componenti dei supporti di base PMP
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentrazione finale 1x
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentrazione finale 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	Codice 12001-988	Concentrazione finale 1x
Componenti dei supporti completi PMP
55 mM di 2-mercaptoetanolo	Gibco	21985023	Concentrazione finale 55 μM
IL-3	PeproTech	200-03	Concentrazione finale 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentrazione finale 100 ng/mL
Supporti di base PMP			Concentrazione finale 1x
Componenti dei setti filtranti di base iMG
DMEM/F12 avanzato	Gibco	12634010	Concentrazione finale 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentrazione finale 1x
Integratore di N2, 100x	Gibco	Codice 17502-048	Concentrazione finale 1x
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentrazione finale 100 U/mL
Componenti dei setti filtranti completi iMG
55 mM di 2-mercaptoetanolo	Gibco	21985023	Concentrazione finale 55 μM
IL-34	PeproTech o Biologend	200-34 o 577904	Concentrazione finale 100 ng/mL
Terreni di base iMG			Concentrazione finale 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentrazione finale 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	Concentrazione finale 50 ng/mL
Componenti dei supporti di base a induzione
DMEM/F12 con HEPES	Gibco	11330032	Concentrazione finale 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentrazione finale 1x
Integratore di N2, 100x	Gibco	Codice 17502-048	Concentrazione finale 1x
Aminoacidi non essenziali (NEAA), 100x	Gibco	11140050	Concentrazione finale 1x
Componenti dei mezzi di induzione completi
Composto E	Calbiochem	Codice: 565790	Concentrazione finale 0,2 μM e ricostituire il reagente stock a 2 mM in etanolo 1:1 e DMSO
Doxiciclina	sigma	D9891	Concentrazione finale di 2 μg/mL e ricostituire il reagente stock a 2 mg/mL in DPBS
Supporti di base a induzione			Concentrazione finale 1x
Inibitore ROCK Y27632	Fisher Scientifico	BD 562822	Concentrazione finale 10 μM
Altri reagenti per colture cellulari
Trypan Blue, soluzione allo 0,4%	AMRESCO INC	K940-100ML
Albumina sierica bovina (BSA)	sigma	Codice 22144-77-0
DPBS con Calcio e Magnesio	Corning	21-030-CV
DPBS senza calcio e magnesio	Corning	21-031-CV	Denominato DPBS
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	Riferito a DMEM-F12 ottimizzato per la crescita di cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte
Proteina di topo laminina, naturale	Gibco	23017015	Riferito alla laminina