Stabilire una coltura cellulare gliale Müller ottenuta da retine di topo

Disclaimer: Tutte le procedure che coinvolgono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Dissociazione della retina

NOTA: Tutti i passaggi successivi (fino al prelievo delle cellule) devono essere eseguiti in una cabina di biosicurezza (BSC) A2 o B2.

1. Preparare la miscela di dissociazione papaina/DNasi I come segue.
   1. Per sei retine, aggiungere 75 μL di DNasi I nella provetta contenente 750 μL di papaina e mescolare accuratamente (miscela di dissociazione).
   2. Per la preparazione del campione individuale richiesta per questo protocollo, suddividere il volume totale di 825 μl in tre aliquote: 275 μl della miscela in una provetta da 1,5 mL per topo (due retine). Calcolare di conseguenza le quantità richieste di DNasi I e Papaina.
      nota: Fino a sei retine possono essere dissociate in una provetta di miscela papaina/DNasi I. Tuttavia, la preparazione dei singoli campioni si traduce in un minor numero di grumi e in una migliore crescita cellulare rispetto ai campioni combinati.
2. Trasferire due retine nella miscela di dissociazione Papaina/DNasi I. Utilizzare una pipetta di trasferimento con un diametro della punta ingrandito, prelevare le retine, attendere che le retine si depositino sul fondo della punta, quindi rilasciare le retine senza un'eccessiva soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) nel tubo contenente la miscela papaina/DNasi I.
3. Mettere su un nutator e incubarlo per 10 minuti in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO₂).
4. Dissociare le cellule pipettando accuratamente su e giù (circa 20-30 volte) con una pipetta da 1 mL. Dopo che le cellule sono state dissociate (cioè, ottenendo una soluzione omogenea senza pezzi), aggiungere 275 μL di inibitore della proteasi Ovomucoide dal kit di dissociazione della papaina per neutralizzare la papaina. Mescolare delicatamente pipettando su e giù. NOTA: Se sei retine sono state dissociate in 825 μL di miscela Papaina/DNasi I, sono necessari 825 μL di Ovomucoide.
5. Centrifugare la miscela a 300 x g per 10 minuti a 4 °C.
6. Aggiungere il fattore di crescita epidermico (EGF, 1 μL per 1 mL del terreno di crescita, ricostituito a 200 μg/mL in PBS) al volume calcolato del terreno di crescita (1 mL per topo) preriscaldato a 37 °C.
   NOTA: A seconda del disegno sperimentale, il marcatore di proliferazione 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), così come il 4-idrossitamoxifene (4-OHT) o altri fattori richiesti possono essere aggiunti all'inizio del periodo di coltura.
7. Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga. Non toccare il pellet sul fondo del tubo.
8. Rimuovere il surnatante con cura e interamente. Risospendere il pellet cellulare con 500 μl di terreno di crescita integrato con EGF.
9. Trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti etichettata (Figura 1C). Sciacquare la provetta con altri 500 μL di terreno di coltura integrato con EGF e aggiungerla al pozzetto (volume totale di 1 mL per pozzetto).
10. Ripetere i passaggi 1.8 e 1.9 con tutti gli altri campioni.
11. Scuotere la piastra a pozzetti tre volte con attenzione (avanti e indietro, sinistra e destra). Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, CO₂).
    nota: Se si utilizzano topi transgenici, eseguire la genotipizzazione per ogni animale (Figura 1D). Identificare i topi positivi e negativi Cre ricombinasi ed etichettare la piastra di conseguenza. Per questo protocollo, per le fasi successive sono state utilizzate solo cellule di topi reporter positivi alla ricombinasi Cre. Le celle dei campioni Cre negativi vengono congelate e utilizzate per altre applicazioni.

2. Fase di crescita

NOTA: La fase di crescita ha una durata di circa 4-5 giorni (Figura 2B). Per aggiungere liquidi ai pozzetti contenenti cellule, la pipetta deve puntare verso la parete del pozzetto e il liquido deve essere rilasciato lentamente per evitare il distacco delle cellule. Non pipettare direttamente sopra le cellule.

1. Un giorno dopo la dissociazione, rimuovere il terreno e aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco integrato con EGF.
2. Il giorno 3, rimuovere il terreno e aggiungere 1 ml di HBSS (temperatura ambiente) per rimuovere i detriti cellulari. Oscilla dolcemente avanti e indietro da sinistra a destra. Rimuovere l'HBSS, ripetere la fase di lavaggio e aggiungere 1 ml di terreno di coltura preriscaldato integrato con EGF.
3. Monitora le cellule ogni giorno e valuta il loro stato di crescita fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 90%-100%. La Figura 3 mostra un esempio di buona crescita della MG nel tempo. Verificare la presenza di possibili contaminazioni o morte cellulare. Scartare le colture contaminate.
   nota: Per monitorare e registrare lo stato delle cellule, è possibile acquisire immagini a vari ingrandimenti utilizzando un microscopio ottico con una fotocamera collegata e obiettivi 4x, 10x o 20x. In questo studio viene utilizzato un microscopio a fluorescenza.

3. Preparazione dei vetrini coprioggetti con poli-L-ornitina (Poly-O) e rivestimento di Laminina

NOTA: Questo passaggio è necessario solo se vengono eseguite la marcatura immunofluorescente e la microscopia confocale a scansione laser. Per una corretta imaging sono necessari vetrini coprioggetti rotondi (diametro 12 mm). Il protocollo di rivestimento può essere trovato anche nella scheda tecnica del mezzo neuronale (vedi Tabella dei materiali).

1. Posizionare con cura i vetrini coprioggetti sterili al centro di ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti utilizzando una pinza Dumont #2AP sterile.
   nota: Posizionare i vetrini coprioggetti al centro del pozzo. Posizionare i vetrini coprioggetti vicino alla parete di un pozzo causerà problemi di tensione superficiale per i passaggi successivi.
2. Scongelare un'aliquota di Poly-O da 2,5 mL a temperatura ambiente e posizionarne 100 μL al centro di ciascun vetrino coprioggetti.
3. Incubare la piastra a pozzetti per 30 minuti in un'incubatrice a 37 °C.
4. Rimuovere Poly-O e lavare il pozzetto con il vetrino coprioggetti tre volte con ~1 ml di acqua sterile.
5. Lasciare asciugare la piastra a fontana per una notte nel BSC. Scongelare 2,5 ml di Laminina a 4 °C durante la notte.
6. La mattina successiva, aggiungere 100 μL di Laminina al centro di ciascun vetrino coprioggetti e incubare per 4 ore in un incubatore a 37 °C.
7. Rimuovere la Laminin con cura e completamente.
8. Mantenere la lastra a 4 °C se non è possibile eseguire immediatamente la passatura.
   nota: I vetrini coprioggetti rivestiti nelle piastre preparate possono essere conservati per alcuni giorni a 4 °C.

4. Passaggio cellulare per rimuovere i sopravvissuti neuronali

NOTA: Il passaggio cellulare è necessario per rimuovere le cellule neuronali, non per aumentare la popolazione cellulare. La glia si divide solo poche volte e non crescerà ulteriormente dopo il passaggio. Non diluire le sospensioni cellulari. Le celle di un pozzetto confluente di una piastra a 12 pozzetti possono essere distribuite su un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti o su due pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Quando si utilizzano vetrini coprioggetti rivestiti, solo circa un terzo del vetrino coprioggetti viene rivestito. Pertanto, sei vetrini coprioggetti che si trovano in una piastra a 24 pozzetti, con cellule confluenti (~80%-90%) possono essere ottenuti da un pozzetto di cellule confluenti di una piastra a 12 pozzetti. È possibile scegliere altri rapporti per aumentare o diminuire la densità cellulare. Per questo protocollo, viene utilizzato un topo reporter Cre+ [un esperimento, due trattamenti: miR-25 o control-miR; repliche tecniche n = 3 (tre vetrini coprioggetti per trattamento), repliche biologiche n = 1]. Il numero di repliche tecniche e biologiche può essere definito in modo diverso a seconda del disegno sperimentale.

1. Controllare se le celle sono confluenti al 90%-100% (anche al margine del pozzetto; Figura 3E, F).
2. Rimuovere il terreno e aggiungere 1 ml di HBSS (temperatura ambiente) per lavare. Scuotere delicatamente la piastra (avanti e indietro, sinistra e destra). Rimuovere completamente l'HBSS.
3. Aggiungere 500 μl di una soluzione contenente tripsina preriscaldata (preriscaldata a 37 °C in un bagno di perle metalliche) per staccare le cellule dal pozzetto. Agitare delicatamente (avanti e indietro, da sinistra a destra) e incubare per 2 minuti in un'incubatrice a 37 °C.
4. Spostare la piastra dall'incubatrice alla BSC. Durante il ribaltamento, aspirare la soluzione contenente tripsina e disperderla con cura e lentamente sul pozzetto più volte fino a quando le cellule non si staccano completamente. Tieni la piastra in controluce e assicurati che non rimangano celle sul fondo.
5. Trasferire questa sospensione cellulare in una provetta sterile da 1,5 mL. Centrifugare a 300 x g per 8 min a 4 °C.
6. Rimuovere il surnatante e risospendere con cura il pellet cellulare aggiungendo 600 μl (100 μl per pozzetto per 6 pozzetti/vetrini) di terreno di crescita preriscaldato (integrato con EGF; 1:1000) e pipettaggio su e giù ~30-40 volte.
   nota: Le celle possono essere congelate in questo momento a -80 °C o in azoto liquido e scongelate seguendo i protocolli standard per lo scongelamento delle linee cellulari. Se le cellule vengono congelate, non verranno risospese in un terreno integrato con EGF (terreno di crescita). Saranno risospesi in un terreno basico (senza EGF) e in una soluzione di congelamento (rapporto 1/1).
7. Seminare le cellule posizionando 100 μl della sospensione di cellule/terreni da 600 μl al centro di sei vetrini coprioggetti rivestiti (vedere la fase 5) della piastra a 24 pozzetti. Posizionare con cura la piastra nell'incubatrice e lasciare che le cellule si depositino.
   NOTA: 100 μl della sospensione cellulare da 600 μl (raccolta da un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti) produrranno una confluenza cellulare del 90%-100%, necessaria per la trasfezione.
8. Controllare le celle dopo 3 ore per vedere se si sono depositate sul vetrino. Aggiungere 400 μl di terreno di coltura integrato con EGF.
   NOTA: Le cellule sono solitamente pronte per la trasfezione il giorno successivo (Figura 3G). Se non sono confluenti (90%-100%), lasciali per un altro giorno. Se ancora non confluenti, non utilizzarli per la trasfezione. Se vengono condotte altre applicazioni a valle, come la profilazione dei miRNA, l'RNA-Seq, la RT-qPCR o il western blot, le cellule devono essere inserite in piastre a 12 pozzetti (rapporto 1:1; non è richiesto alcun trattamento su piastra) e raccolte per l'estrazione di RNA/proteine.

Figura 1: Dissociazione retinica e genotipizzazione. (A) Conchiglia oculare con cornea, cristallino, iride e vitreo rimossi. (B) Retine isolate; le cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) vengono rimosse dopo un lavaggio accurato. (C) Piastra a 12 pozzetti con retine dissociate (due retine per pozzetto). (D) Ritaglio di un esempio di immagine di gel di genotipizzazione. La genotipizzazione è necessaria per identificare i topi che hanno l'espressione della ricombinasi Cre guidata da Ascl1 e sarà utilizzata per monitorare la conversione cellulare. Barre della scala: 1 mm.

Figura 2: Disegno sperimentale e andamento temporale di una coltura primaria della glia di Müller. (A) Schema del topo Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl, un topo reporter progenitore retinico utilizzato per tracciare la conversione della glia di Müller (MG) in cellule progenitrici retiniche (RPC). (B) Andamento temporale dei periodi di coltura costituiti da fase di crescita (blu, 0-4/5 giorni in vitro, div), fase di trasfezione (viola, 5/6-7/8 div) e fase di conversione MG (giallo, inizia 7/8 div). Fase di crescita: le retine dissociate (due retine di un topo) vengono coltivate in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti in un mezzo di crescita. Intorno al giorno 4/6, le cellule vengono fatte passare in una piastra a 24 pozzetti che contiene vetrini coprioggetti rivestiti. Fase di trasfezione: 5-7 cellule div (1 giorno dopo il passaggio) vengono trasfettate con miRNA per 2 giorni in terreno di trasfezione. La Cre ricombinasi è attivata con il 4-idrossitamoxifene (4-OHT). La proliferazione cellulare viene monitorata con EdU. La fase di conversione MG inizia 1 giorno dopo la trasfezione. Le cellule vengono ora coltivate nel mezzo neuronale fino al prelievo (6-7 giorni dopo le trasfezioni, dpTF).

Figura 3: Glia di Müller primaria durante la fase di crescita. (A) L'andamento temporale dei periodi di coltura durante la fase di crescita (0-4/5 giorni in vitro (div)) è evidenziato in blu. (B-G) Immagini dal vivo (fase) della glia di Müller (MG) durante la fase di crescita dopo 1 div (B), 2 div dopo il cambiamento del mezzo (C), 3 div (D), 4 div prima del passaggio (E,F) e 5 div, 1 giorno dopo il passaggio e prima della trasfezione (G). I corpi cellulari MG sono indicati da punte di freccia rosse. Dopo 3 div, le colture sono confluenti al 60%-80% (D), dopo 4-5 div, le colture sono confluenti al 90%-100% e pronte per essere passate (E-F). Dopo il passaggio sui vetrini, le colture cellulari devono essere confluenti all'80%-90% per la successiva trasfezione (G). Barre di scala: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F).