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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione del buffer
NOTA: Se si esegue il sequenziamento dell'RNA a valle, trattare accuratamente tutti gli spazi di lavoro e gli strumenti con la soluzione di decontaminazione dell'RNasi per prevenire la degradazione dell'mRNA.
- Preparare il tampone di lisi.
- Sciogliere in acqua distillata (H2O) fino a 50 mL: 5,47 g di saccarosio (0,32 M finale), 250 μL di cloruro di calcio 1 M (CaCl2) (5 mM finale), 150 μL di acetato di magnesio 1 M [Mg(CH3COO)2)(3 mM finale), 10 μL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 500 mM (0,1 mM finale), 500 μl di acido tris-cloridrico 1 M (Tris-HCl) (pH 8) (10 mM finale), 50 μl di Triton X-100 (0,1% finale) e 17 μl di 3 M ditiotreitolo (DTT, 1 mM finale, aggiungere fresco) (vedere la Tabella dei materiali).
- Preparare il tampone di saccarosio
- Sciogliere quanto segue in H2O distillato fino a 50 mL: 30,78 g di saccarosio (1,8 M finale), 150 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM finale), 500 μL di 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 17 μL di 3 M DTT (1 mM finale, aggiungere fresco).
2. Dissociazione di tessuto congelato in sospensione a nucleo singolo
- Aggiungere 4 ml di tampone di lisi ghiacciato a un tampone di vetro da 7 ml (grinder) e conservare in ghiaccio. Sezionare circa 200-400 mg di corteccia adulta umana appena congelata, infilare circa 50 volte e trasferire l'omogeneizzato di tessuto in una provetta in polipropilene ultracentrifuga da 12 mL.
- Utilizzando una pipetta da 5 ml, aggiungere 6,5 ml di tampone di saccarosio ghiacciato sul fondo della provetta per ultracentrifuga, facendo attenzione a non disturbare lo strato tra il saccarosio e l'omogeneizzato tissutale.
NOTA: Se si elaborano campioni aggiuntivi, bilanciare attentamente le provette in base al peso aggiungendo ulteriore tampone di lisi al campione più leggero. Il bilanciamento preciso delle provette per ultracentrifuga è essenziale per evitare danni al rotore e garantire la rotazione alla velocità corretta.
3. Ultracentrifugazione
- Ultracentrifugare il lisato a 24.400 giri/min (101.814 × g) per 1 ora a 4 °C. Aspirare accuratamente il surnatante e i detriti senza disturbare il pellet.
nota: Un pellet potrebbe non essere visibile se si inizia con meno di 200 mg di tessuto.
- Aggiungere 600 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (priva di calcio (Ca2+), magnesio (Mg2+)) al pellet di nuclei e incubare su ghiaccio per 10 minuti prima di rimettere in sospensione.
- Pipettare su e giù 50 volte per risospendere il pellet di nuclei sul ghiaccio.
- Utilizzare un emocitometro per visualizzare i nuclei intatti al microscopio e assicurarsi che la concentrazione della risospensione sia superiore a 10-5 nuclei/mL prima di procedere alla fase successiva (combinare 10 μL dei nuclei risospesi con 10 μL di blu di tripano).
4. Incubazione degli anticorpi
- Per immunotaggare il campione per lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS), aggiungere 500 μL di pellet di campione risospeso, 490 μL di 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di albumina sierica bovina al 10% (BSA) (0,1% finale), 1 μL di anticorpo anti-NeuN di topo coniugato ad AF (Alexa fluor)555 (NeuN-AF555, concentrazione finale 1:1000), e 1 μL di anticorpo di topo anti-PAX6 coniugato alloficocianina (PAX6-APC, concentrazione finale 1:1000).
nota: Possono essere aggiunti anticorpi alternativi coniugati ad altri fluorofori. Qui, l'anti-OLIG2 di topo coniugato ad AF488 (concentrazione 1:1000) è stato utilizzato con risultati favorevoli.
- Eseguire controlli solo 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e monocolore per impostare i parametri di gating, utilizzando una piccola quantità di campione se necessario.
- Per eseguire un controllo monocolore AF555, aggiungere 20 μl del pellet campione risospeso, 970 μl di 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μl di 10% BSA (0,1% finale) e 1 μl di anticorpo NeuN-AF555 (concentrazione 1:1000).
- Per eseguire un controllo APC monocolore, aggiungere 20 μl di pellet di campione risospeso, 970 μl di 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μl di 10% BSA (0,1% finale) e 1 μl di anticorpo PAX6-APC (concentrazione 1:1000).
- Per eseguire il controllo solo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo), aggiungere 20 μl di pellet campione risospeso, 970 μl di 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libero) e 10 μl di 10% BSA (0,1% finale) (DAPI verrà aggiunto in seguito, vedere 4.4).
nota: Se vengono utilizzati più di due anticorpi, si consiglia di eseguire il controllo a fluorescenza meno uno (FMO) in aggiunta ai controlli a colore singolo.
- Incubare i campioni e i controlli con rotazione al buio per 1 ora a 4 °C.
- Aggiungere DAPI a 1:1000 a tutti i campioni e i controlli e procedere con l'ordinamento.