Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Raccolta dei tessuti
- Preparare il tampone X dal kit di dissociazione neurale aggiungendo beta-mercaptoetanolo al tampone X fino a una concentrazione finale di 0,067 mM (per 4 campioni, aggiungere 13,5 μl di 50 mM di beta-mercaptoetanolo a 10 ml di tampone X).
- Preparare la Miscela Enzimatica 1 mescolando 50 μl di Enzima P con 1.900 μl di Buffer X per ciascun campione, come descritto nel protocollo per il Neural Dissociation Kit. Ad esempio, per 4 campioni, mescolare 200 μl di Enzima P con 7.600 μl di Buffer X.
- Mettere il tampone X nel bagnomaria a 37 ºC.
- Mettere 2 ml di soluzione salina tamponata fredda di Hank (HBSS) (senza Ca++ e Mg++) in un pozzetto di una piastra di coltura sterile a 6 pozzetti per ogni campione che verrà raccolto e conservato su ghiaccio per la dissezione tissutale.
2. Dissociazione neurale (1 ora)
- Tagliare ogni campione di tessuto in piccoli pezzi utilizzando lame di rasoio sterili sul coperchio della piastra di coltura a 6 pozzetti. Questo protocollo è stato utilizzato per campioni di tessuto di circa 30 - 100 mg, ma è approvato per campioni di tessuto fino a 400 mg. Per campioni di tessuto di dimensioni superiori a 400 mg, i volumi dei reagenti devono essere aumentati in modo appropriato.
- Utilizzare 1 ml di HBSS fresco senza Ca2+ e Mg2+ per trasferire i pezzi di tessuto tagliati a dadini con una pipetta in una provetta da centrifuga sterile da 2 ml. Ripetere i passaggi 2.1 e 2.2 per tutti i campioni fino a quando tutti i campioni non sono stati trasferiti in una provetta da centrifuga da 2 ml.
- Centrifugare i campioni a 300 x g per 2 minuti a RT e aspirare il surnatante.
- Aggiungere 1.900 μl di Enzyme Mix 1 caldo, come preparato nei passaggi 1.2 e 1.3, a ciascun campione e chiudere le provette.
- Incubare i campioni per 15 minuti nel bagno d'acqua a 37 ºC, capovolgendo le provette più volte ogni 5 minuti per risospendere i pezzi di tessuto depositati.
- Nel frattempo, preparare la Miscela Enzimatica 2 mescolando 20 μl di Buffer Y con 10 μl di Enzima A scongelato (per 4 campioni, mescolare 80 μl di Buffer Y con 40 μl di Enzima A scongelato).
- Aggiungere 30 μl di Enzyme Mix 2 a ciascun campione e capovolgere delicatamente. Non vortice.
- Dissociare ogni campione di tessuto con la pipetta Pasteur "1", triturando su e giù 30 volte.
- Incubare i campioni per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 ºC; capovolgere le provette più volte ogni 5 minuti per risospendere i pezzi di tessuto depositati.
- Dissociare ogni campione di tessuto con la pipetta Pasteur "2", triturando su e giù 30 volte, evitando di generare bolle.
- Dissociare ogni campione di tessuto con la pipetta Pasteur "3", triturando su e giù 30 volte, evitando di generare bolle.
- Incubare i campioni per 10 minuti in un bagno d'acqua a 37 ºC; capovolgere le provette più volte ogni 5 minuti per risospendere le cellule depositate.
- Applicare la sospensione unicellulare a un ceppo cellulare da 80 micron posizionato sopra una provetta Falcon da 15 ml per rimuovere eventuali detriti di grandi dimensioni e lavare il filtro e le celle con 10 ml di HBSS (con Ca2+ e Mg2+) per arrestare le reazioni enzimatiche. Ripetere l'operazione fino a quando ogni campione non viene trasferito in una provetta con falco da 15 ml pulita.
- Centrifugare i campioni a 300 x g per 10 minuti a RT e aspirare il surnatante.
3. Deplezione della mielina (45 min)
- Risospendere accuratamente il pellet di cellule con 400 μl di tampone di rimozione della mielina.
- Aggiungere una quantità specificata di perle per la rimozione della mielina e pipettare su e giù per mescolare accuratamente.
nota: Il volume delle perle per la rimozione della mielina utilizzate dipenderà dalle dimensioni del tessuto, dall'età dell'animale e dalla quantità di mielina prevista in quella particolare regione del cervello. Ad esempio, per un campione di ippocampo di ratto adulto (circa 300 mg), incubare il campione con 100 μl di perle per la rimozione della mielina.
- Incubare per 15 minuti in frigorifero a 4 ºC.
- Lavare ogni campione con 5 ml di tampone per la rimozione della mielina.
- Centrifugare i campioni a 300 x g per 10 minuti a RT.
- Durante la centrifugazione dei campioni, posizionare 1 colonna per ogni campione nel campo magnetico del selezionatore magnetico e posizionare un filtro pulito da 80 micron sopra ogni colonna.
- Preparare le colonne e filtrare risciacquando ogni colonna con 1 ml di tampone per la rimozione della mielina tre volte (3 ml in totale). Raccogli tutto il flusso in un contenitore per rifiuti, come il fondo di una scatola di puntali vuota.
- Posizionare una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 ml direttamente sotto ciascuna colonna in preparazione della raccolta del campione.
- Quando le cellule hanno terminato la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospenderlo accuratamente in 500 μl di tampone di rimozione della mielina. Applicare immediatamente la sospensione cellulare alla colonna e raccogliere le cellule nel tubo sottostante.
- Lavare il filtro e la colonna con 1 ml di tampone per la rimozione della mielina, 4 volte (4 ml in totale).
- Centrifugare la raccolta cellulare a 300 x g per 10 minuti a RT.
- Aspirare il surnatante e le cellule sono ora pronte per la colorazione.
4. Colorazione di cellule vive per FACS (1 ora per la colorazione)
- Agitare brevemente (2 sec) le cellule per separare il pellet e aggiungere immediatamente 5 μl di blocco Fc (anti-cluster di differenziazione 32, CD32), agitare nuovamente e incubare in frigorifero a 4 ºC per 5 min.
- Nel frattempo, preparare la miscela di anticorpi primari aggiungendo i tre anticorpi primari nel tampone di lavaggio come segue: 0,125 μl di anticorpo CD11b coniugato con alloficocianina (APC) (1:800), 1 μl di anticorpo anti-GLT1 (1:100) e 0,4 μl di isotiocianato di fluoresceina (FITC) – anticorpo Thy1 coniugato (1:250) per ogni 100 μl di tampone di lavaggio. Ogni campione riceverà 100 μl di miscela di anticorpi primari per l'incubazione; Tuttavia, se il campione è molto più grande di 400 mg di tessuto, si consiglia di aumentare di conseguenza il volume della miscela di anticorpi primari
- Preparare le provette per i controlli di colorazione singola rimuovendo solo 2 μl di cellule da ciascuna provetta del campione e aggiungendole a ciascuna provetta di controllo della colorazione. I controlli "a colorazione singola" includono: solo APC-CD11b, solo GLT1, solo FITC-Thy1, solo anticorpi secondari PE e il controllo "bianco" o non colorato.
nota: Tutti i campioni devono essere rappresentati in tutti i controlli di colorazione, quindi 2 μl di cellule da ciascun campione devono essere aggiunti a ciascuna provetta di controllo della colorazione.
- Agitare brevemente le provette (2 sec) e aggiungere 100 μl di miscela di anticorpi primari a ciascuna provetta campione e 100 μl di anticorpo primario appropriato a ciascuna provetta di controllo della colorazione, agitare nuovamente le provette, coprire le provette con un foglio di alluminio per proteggere gli anticorpi fluorescenti dalla luce e incubare le provette in frigorifero a 4 ºC per 20 minuti. I campioni devono essere mantenuti freschi (a 4 ºC) per il resto della procedura per mantenere l'integrità dei campioni e degli anticorpi.
- Agitare brevemente le provette e aggiungere 2 ml di tampone di lavaggio a ciascuna provetta.
- Provette da centrifuga a 350 x g per 5 min a 4 ºC.
- Nel frattempo, preparare la miscela di anticorpi secondari aggiungendo 0,2 μl di anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con PE per ogni 100 μl di tampone di lavaggio. Ogni campione riceverà 100 μl di miscela di anticorpi secondari; Tuttavia, se il campione è molto più grande di 400 mg di tessuto, si consiglia di prendere in considerazione l'idea di aumentare di conseguenza il volume della miscela di anticorpi primari.
- Al termine della centrifugazione, versare il surnatante di ciascun campione nel lavandino e tamponare le provette capovolte su un tovagliolo di carta.
- Agitare brevemente le provette e aggiungere 100 μl di miscela di anticorpi secondari a ciascuna provetta del campione e l'anticorpo secondario appropriato a ciascun controllo di colorazione. Quindi, agitare nuovamente le provette, coprirle con un foglio di alluminio e incubarle in frigorifero a 4ºC per 15 min.
nota: La provetta di controllo della colorazione solo GLT1 dovrebbe ricevere la miscela di anticorpi secondari.
- Dopo l'incubazione, agitare brevemente le provette e aggiungere 2 ml di tampone di lavaggio a ciascuna provetta.
- Centrifugare le provette a 350 x g per 5 minuti a 4ºC.
- Al termine della centrifugazione, versare il surnatante di ciascun campione nel lavandino e tamponare le provette capovolte su un tovagliolo di carta.
- Agitare le provette e aggiungere 0,25 ml di PBS sterile a ciascuna provetta. I campioni sono pronti per lo smistamento.
nota: Più cellule possono richiedere 0,5 ml di PBS sterile; Tuttavia, è meglio iniziare con un volume inferiore, poiché il campione può sempre essere diluito se è troppo concentrato con le cellule.
nota: Opzionalmente aggiungere DNasi alla provetta per evitare che le cellule si aggreghino e quindi ostruiscano lo smistatore. I campioni possono anche essere filtrati utilizzando un filtro sterile da 80 micron appena prima dello smistamento per evitare l'intasamento dello smistatore.
