1. Preparazione e raccolta di vermi invecchiati per l'isolamento cellulare
- Raccogli i vermi e prepara i tamponi per l'isolamento delle cellule.
- Raccogliere i vermi in una provetta conica da 15 mL. Lavare le viti senza fine dalla piastra con 1,5 mL di tampone M9 (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4, pH 7,0) e centrifugare per 5 minuti a 1.600 x g. Scartare il surnatante e lavare i vermi con 1 mL di tampone M9. Ripetere la centrifugazione e il lavaggio per un totale di cinque volte per rimuovere il più possibile la contaminazione da Escherichia coli.
NOTA: L'aggiunta di antibiotici (50 μg/mL), come l'ampicillina, in questa fase può aiutare a ridurre la contaminazione batterica.
- Per due campioni, preparare 2 mL di tampone di lisi sodio dodecil solfato-ditiotreitolo (SDS-DTT): 200 mM DTT, 0,25% (p/v) SDS, 20 mM HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico) (pH 8,0) e 3% (p/v) saccarosio.
- Preparare 15 mL di tampone di isolamento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7,3]) e conservarlo su ghiaccio.
nota: Sia il tampone di lisi SDS-DTT che il tampone di isolamento devono essere rinnovati prima di ogni esperimento.
- Rottura delle cuticole e isolamento di singole cellule
- Centrifugare gli animali raccolti nella fase 1.1.1 per 5 minuti a 1.600 x g. Rimuovere tutto il surnatante e sospendere i vermi in 1 mL di terreno M9 e trasferirli in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Viti senza fine in pellet con centrifugazione a 1.600 x g per 5 min.
- Aggiungere 200 μl di tampone di lisi SDS-DTT ai vermi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). I vermi dovrebbero sembrare "ammiccati" lungo il corpo se osservati al microscopio ottico.
nota: L'esposizione prolungata al tampone di lisi SDS-DTT può provocare la morte dei vermi, che può essere monitorata osservando i vermi. I vermi morti si allungheranno e non si arriccieranno.
- Aggiungere 800 μl di tampone isolante ghiacciato e mescolare agitando delicatamente la provetta.
- Pellettare i vermi per 1 minuto a 13.000 x g a 4 °C, rimuovere il surnatante e lavare con 1 mL di tampone isolante.
- Ripetere il passaggio 1.3.5 per un totale di cinque volte, rimuovendo ogni volta con cura il buffer di isolamento.
- Aggiungere 100 μL di miscela di proteasi di Streptomyces griseus (15 mg/mL) (Tabella dei materiali) disciolta in tampone di isolamento al pellet e incubare per 10-15 minuti a RT.
nota: Come per il tampone di lisi SDS-DTT, la digestione prolungata della proteasi può provocare un'eccessiva scissione delle proteine lungo la membrana plasmatica, impedendo l'isolamento della proteina fluorescente verde (GFP) esposta sulla superficie tramite biglie magnetiche.
- Durante l'incubazione con la miscela di proteasi, applicare la disgregazione meccanica pipettando i campioni su e giù contro il fondo della provetta per microcentrifuga da 1,5 ml con un puntale per micropipetta da 200 μl per ~60-70 volte. Tenere il puntale della pipetta contro la parete della provetta per microcentrifuga con una pressione costante per dissociare correttamente le cellule.
- Per determinare lo stadio della digestione, rimuovere un piccolo volume (~1-5 μL) della miscela di digestione, lasciarla cadere su un vetrino e ispezionarla utilizzando un microscopio per colture tissutali. Dopo 5-7 minuti di incubazione, i frammenti di verme dovrebbero avere una cuticola visibilmente ridotta e un impasto di cellule sarà facilmente visibile.
- Arrestare la reazione con 900 μL di terreno L-15 freddo disponibile in commercio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e penicillina-streptomicina (concentrazione finale a 50 U/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina).
- Pellet isolare frammenti e cellule mediante centrifugazione per 5 minuti a 10.000 x g a 4 °C. Lavare le celle pellettate con 1 mL di terreno freddo integrato con L-15 altre due volte per assicurarsi che i detriti e le cuticole in eccesso vengano rimossi.
- Risospendere le cellule pellettate in 1 mL di terreno integrato con L-15 e lasciare in ghiaccio per 30 minuti. Portare lo strato superiore, circa 700-800 μl, in una provetta da microcentrifuga. Questo strato contiene cellule prive di detriti cellulari e verrà utilizzato nel successivo isolamento delle cellule di interesse.
- Seguendo le istruzioni del produttore, utilizzare un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro per misurare la densità cellulare di 10-25 μL di cellule isolate.
2. Isolamento di cellule GFP-positive tramite citometria a flusso
- Isolamento di cellule GFP-positive mediante citometria a flusso
- Dalla sospensione cellulare isolata raccolta nella fase 1.2.12, centrifugare le celle per 5 minuti a 10.000 x g a 4 °C. Scartare il surnatante e sospendere le cellule pellettate in terreno integrato con L-15 fino a una densità cellulare non superiore a 6 x 106 cellule/mL per evitare di sovraccaricare il citometro a flusso.
- Ordinare le cellule in base all'espressione GFP-positiva utilizzando un citometro a flusso in grado di selezionare i campioni. Le cellule GFP-negative possono essere utilizzate come controllo per l'analisi non specifica del tipo di cellula.
- Coltura di cellule isolate
- Piastra di cellule isolate in una piastra sterile a 6 pozzetti multipozzetti.
nota: Queste piastre possono essere rivestite con lectina di arachidi per aumentare l'adesione delle cellule; Tuttavia, se le celle devono essere utilizzate immediatamente, questo passaggio potrebbe essere ignorato.
- Collocare la piastra in un contenitore di plastica e incubare le cellule a 20 °C con un panno umido o carta velina morbida (aggiungere 50 μg/mL di ampicillina all'acqua distillata doppia [ddH2O] per garantire l'assenza di crescita batterica sul salvietto) per aggiungere umidità alle cellule. Non incubare in un incubatore di CO2, poiché livelli elevati di CO2 possono danneggiare le cellule.
