Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dissezione dell'embrione di pollo Giorno 14 (e14) Cervelletto
- Incubare le uova di gallina brune fecondate a 38 °C fino al giorno 14 embrionale.
- Usando le forbici per le uova, decapitare l'embrione di pollo in ovulo e rimuovere la testa in una capsula di Petri contenente soluzione salina tampone fosfato ghiacciata (PBS) (Figura 1A).
- Usando una pinza standard, praticare incisioni dietro ciascun occhio fino in fondo al tessuto, rimuovendo gli occhi e la mascella superiore. Praticare una seconda incisione attraverso la faringe, rimuovendo la mascella inferiore (Figura 1B).
- Utilizzando una pinza standard, rimuovere tutta la pelle dalla superficie di un cranio staccandola (Figura 1C) e rimuovere le ossa frontali e parietali, rivelando il cervello.
- Da un aspetto ventrale, rimuovere la cartilagine faringea e il mesenchima ausiliario.
- Da un punto di vista dorsale, rimuovere con cura il mesenchima dorsale al rombencefalo, facendo attenzione a non danneggiare il pia, e separare l'intero cervello (Figura 1D).
- Praticare un'incisione attraverso il tessuto tra il mesencefalo e il rombencefalo e separare il rombencefalo, compreso il cervelletto (Figura 1E).
- Rimuovere l'intero cervelletto praticando incisioni lungo tutto il tessuto in entrambe le giunzioni laterali del cervelletto e della placca alare del rombencefalo, facendo attenzione a mantenere l'integrità della pia durante la dissezione (Figura 1F). Inoltre, rimuovere il plesso coroideo in formazione (Figura 1G).
- Sposta il cervelletto sezionato nella soluzione salina bilanciata ghiacciata di Hank (HBSS).
2. Fetta Cultura del Cervelletto e14
- Trasferire l'intero cervelletto sulla piattaforma sterile di un tritatessuti utilizzando una spatola o una pipetta Pasteur da 3 ml con la punta tagliata per allargare l'apertura. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando una pipetta.
- Tagliare l'intero cervelletto nell'orientamento richiesto a 300 μm di spessore utilizzando il set di trinciatessuti con una velocità di taglio del 50% del massimo. L'integrità dei tessuti è più facilmente preservata nella sezione sagittale; tuttavia, anche l'orientamento è una considerazione importante per l'analisi cellulare (i dendriti delle cellule di Purkinje sono allineati sagittalmente, mentre gli assoni delle cellule dei granuli corrono trasversalmente, perpendicolarmente al piano dei dendriti delle cellule di Purkinje).
- Utilizzando una pipetta Pasteur da 3 ml, coprire il cervelletto affettato con HBSS ghiacciato.
- Trasferire le fette in HBSS in una capsula Petri da 60 mm contenente HBSS fresco ghiacciato utilizzando una pipetta Pasteur da 3 ml con punta tagliata.
- Sotto un microscopio da dissezione illuminato con una sorgente di luce a fibre ottiche, garantire la separazione delle singole fette utilizzando una pinza per orologiaio.
nota: Ogni dissezione, dall'embrione all'incubazione della fetta nel terreno di coltura, dura circa 10-20 minuti, a seconda dell'esperienza. Esegui le dissezioni una alla volta per assicurarti che il cervelletto trascorra il minor tempo possibile tra la decapitazione e la coltura ex vivo.
