Stabilire colture primarie di cellule gliali miste da un midollo spinale di topo

Abstract

Fonte: Malon, J. T., et al. Preparazione di colture gliali miste primarie da tessuto del midollo spinale di topo adulto. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare cellule gliali miste primarie da tessuto del midollo spinale di topo adulto. Il protocollo prevede la digestione enzimatica del tessuto, seguita dalla rimozione delle membrane cellulari rotte e dei detriti mielinici per ottenere una popolazione unicellulare. Le cellule vengono quindi coltivate in terreni ottimizzati per la crescita di cellule gliali miste.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni in una cappa di coltura in condizioni asettiche

1. Preparare i terreni di coltura: completare la modifica di Dulbecco dei terreni di Eagle (cDMEM) contenenti DMEM (con 4,5 g/L di glucosio), 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina, 100 UI/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, 250 ng/mL di amfotericina B e 50 μM di 2-mercaptoetanolo (2-ME; vedere 1.1.1). Mescolare e filtrare, sterilizzare tutti gli altri componenti e quindi aggiungere FBS. Conservare il terreno di coltura a 4 ^°C.
   1. Preparare 50 mM di soluzione madre 2-ME/soluzione salina tamponata con fos....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Modifica di Dulbecco del terreno di Eagle's (DMEM) con 4,5 g/L di glucosio	Lonza	12-709F	Il terreno cDMEM è un terreno di coltura standard e ampiamente utilizzato. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare il DMEM e tutti gli altri componenti utilizzati per realizzare i media cDMEM.
L-Glutammina (100x)	Lonza	17-605E	La L-glutammina è un componente standard e ampiamente utilizzato per vari terreni di coltura. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare la L-glutammina.
Soluzione antibiotico-antimicotica (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	Si tratta di una combinazione di penicillina, streptomicina e amfotericina formulata per contenere 10.000 unità/mL di penicillina G, 10 mg/mL di streptomicina solfato e 25 μg/mL di amfotericina B. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare i singoli componenti.
2-mercaptoetanolo (2-ME)	Sigma-Aldrich	Codice: M3148	Un BioReagente, adatto per colture cellulari, biologia molecolare ed elettroforesi.
Sistema di dissociazione della papaina	Società biochimica Worthington	LK003150	I singoli componenti di questo kit possono essere acquistati separatamente.
Percoll	GE Assistenza sanitaria	Codice 17-0891-01	Percoll è venduto come soluzione sterile. Se necessario, il Percoll non diluito può essere risterilizzato in autoclave.
Incubatore/agitatore da laboratorio	Barstead/Lab-line	MaxQ4000	Questa è l'incubatrice/agitatrice che abbiamo attualmente. Al loro posto possono essere utilizzati altri tipi di agitatori.