Stabilire colture primarie di cellule gliali miste da un midollo spinale di topo

Abstract

Fonte: Malon, J. T., et al. Preparazione di colture gliali miste primarie da tessuto del midollo spinale di topo adulto. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare cellule gliali miste primarie da tessuto del midollo spinale di topo adulto. Il protocollo prevede la digestione enzimatica del tessuto, seguita dalla rimozione delle membrane cellulari rotte e dei detriti mielinici per ottenere una popolazione unicellulare. Le cellule vengono quindi coltivate in terreni ottimizzati per la crescita di cellule gliali miste.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni in una cappa di coltura in condizioni asettiche

1. Preparare i terreni di coltura: completare la modifica di Dulbecco dei terreni di Eagle (cDMEM) contenenti DMEM (con 4,5 g/L di glucosio), 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina, 100 UI/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, 250 ng/mL di amfotericina B e 50 μM di 2-mercaptoetanolo (2-ME; vedere 1.1.1). Mescolare e filtrare, sterilizzare tutti gli altri componenti e quindi aggiungere FBS. Conservare il terreno di coltura a 4 ^°C.
   1. Preparare 50 mM di soluzione madre 2-ME/soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): aggiungere 100 μL di 2-ME concentrato (14,3 M) in 28,6 mL di 1x PBS e sterilizzare con filtro (la soluzione può essere conservata a 4 ^°C per diversi mesi). Utilizzare 1 mL di soluzione madre 2-ME per ogni 1.000 mL di terreno di coltura.
2. Preparazione del terreno di gradiente di densità
   1. Preparare una soluzione stock di terreni a gradiente di densità isotonica (ad es. 100% Percoll) da 1 parte di 10 PBS sterili regolari e 9 parti di terreni sterili a gradiente di densità stock (ad es. Percoll).
   2. Diluire il terreno a gradiente di densità al 100% (prodotto in 1.2.1) con il normale PBS sterile 1x per ottenere un terreno a gradiente di densità del 20% (ad esempio, 10 mL di terreno a gradiente di densità al 100% con 40 mL di 1x PBS) e conservarlo a 4 ^°C. Portare il terreno a gradiente di densità al 20% a temperatura ambiente (RT) prima di preparare la coltura cellulare.
3. Preparazione di soluzioni dal sistema di dissociazione della papaina
   NOTA: Il sistema di dissociazione della papaina può essere identificato nella Tabella dei Materiali. Possono essere utilizzati anche altri kit di dissociazione simili (compresi quelli assemblati internamente). Tutti i componenti devono essere sterili.
   1. Aggiungere 32 ml di soluzione salina bilanciata (EBSS) di Earle alla miscela di inibitori degli ovomucoidi (polvere).
   2. Aggiungere 5 mL di EBSS in un flaconcino di papaina (polvere). Mettere il flaconcino di papaina a bagnomaria a 37 ^°C per 10 minuti o fino a quando la papaina non si sarà sciolta.
   3. Aggiungere 500 μl di EBSS a un flaconcino di DNasi (polvere). Mescolare delicatamente.
   4. Aggiungere 250 μl della soluzione di DNasi (sopra) al flaconcino di papaina.
   5. Calcolare la quantità totale della suddetta miscela papaina/DNasi necessaria (circa 800 μL di miscela papaina/DNasi per midollo spinale di topo) e trasferire la miscela necessaria in una provetta da 50 ml per la digestione dei tessuti. Conservare il residuo nel flaconcino originale a 4 °C per almeno due settimane.
   6. Tenere tutti i componenti dei kit sul ghiaccio fino al momento del bisogno.
4. Preparare le provette per la raccolta del midollo spinale: una provetta sterile da 15 ml con 5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS; dal sistema di dissociazione della papaina, per la raccolta del midollo spinale) e una provetta sterile da 15 ml con 1x PBS (per riempire la siringa da 5 ml). Inoltre, preparare una capsula di Petri sterile (35 mm o 60 mm) con 5 ml di HBSS e conservarla nella cappa di coltura.

2. Preparazione della sospensione a cella singola

Nota: Esegui i passaggi 3 e 4 in un cappuccio di coltura per mantenere tutto sterile.

1. Trasferire tutto il midollo spinale nella capsula di Petri contenente HBSS. Taglia ciascuno dei cordoni spinali in tanti pezzi piccoli e fini con forbici e pinze sterili. Trasferire il tessuto del midollo spinale nella provetta conica da 50 mL contenente la miscela di enzimi papaina/DNasi preparata (passaggio 1.3.5) utilizzando una pinza sterile o una pipetta da 10 mL (evitare di aggiungere HBSS alla miscela di enzimi, poiché ciò diluirà ulteriormente la soluzione enzimatica preparata e potrebbe comportare una riduzione delle prestazioni dell'enzima).
2. Agitare delicatamente il tubo per mescolare. Incubare la provetta a 37 ^oC per 1 ora in un'incubatrice/agitatore con agitazione orbitale a 150 giri/min.
3. Agitare nuovamente la provetta e triturare energicamente la soluzione enzimatica con il tessuto utilizzando una pipetta da 5 ml per favorire un'ulteriore dissociazione.
4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a RT.
5. Durante la centrifugazione, miscelare 2,7 mL di EBSS con 300 μL di soluzione ricostituita di inibitore dell'albumina-ovomucoide (1.3.1) in una provetta sterile. Aggiungere 150 μl della soluzione di DNasi (passaggio 1.3.3).
6. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con la soluzione preparata sopra (passaggio 1.5). Agitare bene per rompere il pellet della cella.
7. Aggiungere 3 mL di soluzione ricostituita di inibitore dell'albumina-ovomucoide (fase 1.4.1) alla sospensione cellulare. Centrifugare le cellule a 70 x g per 6 minuti a RT. Rimuovere il surnatante (che contiene frammenti di membrana).

3. Ulteriore rimozione della mielina dalla sospensione a cellula singola

1. Aggiungere 8 mL di terreno con gradiente di densità al 20% (preparato al punto 1.2.2) nella provetta contenente il pellet di cellule, agitare delicatamente per disgregare il pellet e centrifugare le celle a 800 x g per 30 minuti a RT senza frenare. Rimuovere con cura lo strato superiore di detriti (principalmente mielina) e il surnatante, ma conservare il pellet.
2. Per rimuovere i residui del gradiente di densità, lavare le cellule risospendendo il pellet cellulare con 8 mL di cDMEM diluito (1 parte di cDMEM e 2 parti di HBSS). Centrifugare le cellule a 400 x g per 10 minuti a 4 ^oC. Rimuovere il surnatante e lavare nuovamente le cellule con il cDMEM diluito (sopra) nello stesso modo. Tenete le cellule sul ghiaccio fino a quando non le seminate.
3. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura (cDMEM fornito con 2-ME (preparato al punto 1.1)). Per una piastra da 12 pozzetti, utilizzare 3 mL x 4 (numero di topi utilizzati) + 2 mL = 14 mL di terreno. Ciò garantirà che vi sia una sospensione cellulare sufficiente per l'intera piastra (12 pozzetti) e fornirà pozzetti extra che possono essere utilizzati per determinare il numero medio di cellule per pozzetto e il contenuto microgliale della coltura. Se si utilizzano altri tipi di recipienti di coltura, calcolare proporzionalmente il volume totale dei terreni di coltura necessari.
4. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
5. Incubare le cellule a 35,9 ^oC con il 5% di CO₂.
6. Cambiare il terreno (rimuovere il vecchio terreno tramite aspirazione) su D 1 e successivamente ogni 3 - 4 giorni (in genere cambiare il terreno su D: 1, 4, 8 e 11, quindi utilizzare le celle il giorno 12).
   nota: Il giorno 1, la coltura può contenere quantità significative di detriti a causa del residuo di mielina dal tessuto del midollo spinale; Pertanto, si consiglia di cambiare i media il giorno 1. Le colture sono pronte per il trattamento tra D 12 e 14. Le cellule di solito sono confluenti all'80% a D 12 e possono essere vicine al 100% confluenti a D 14. Tipicamente, su D 12, ci sono circa 100.000 celle per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Modifica di Dulbecco del terreno di Eagle's (DMEM) con 4,5 g/L di glucosio	Lonza	12-709F	Il terreno cDMEM è un terreno di coltura standard e ampiamente utilizzato. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare il DMEM e tutti gli altri componenti utilizzati per realizzare i media cDMEM.
L-Glutammina (100x)	Lonza	17-605E	La L-glutammina è un componente standard e ampiamente utilizzato per vari terreni di coltura. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare la L-glutammina.
Soluzione antibiotico-antimicotica (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	Si tratta di una combinazione di penicillina, streptomicina e amfotericina formulata per contenere 10.000 unità/mL di penicillina G, 10 mg/mL di streptomicina solfato e 25 μg/mL di amfotericina B. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare i singoli componenti.
2-mercaptoetanolo (2-ME)	Sigma-Aldrich	Codice: M3148	Un BioReagente, adatto per colture cellulari, biologia molecolare ed elettroforesi.
Sistema di dissociazione della papaina	Società biochimica Worthington	LK003150	I singoli componenti di questo kit possono essere acquistati separatamente.
Percoll	GE Assistenza sanitaria	Codice 17-0891-01	Percoll è venduto come soluzione sterile. Se necessario, il Percoll non diluito può essere risterilizzato in autoclave.
Incubatore/agitatore da laboratorio	Barstead/Lab-line	MaxQ4000	Questa è l'incubatrice/agitatrice che abbiamo attualmente. Al loro posto possono essere utilizzati altri tipi di agitatori.