Differenziazione delle cellule progenitrici otiche in cellule epiteliali sensoriali seguita da immunocolorazione

Abstract

Fonte: Azadeh, J. et al., Avvio della differenziazione in cellule progenitrici otiche multipotenti immortalizzate.J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra la differenziazione delle cellule progenitrici otiche multipotenti immortalizzate (iMOP) in cellule epiteliali sensoriali. Delinea le fasi coinvolte nella coltura delle cellule iMOP, nella formazione delle otosfere, nell'induzione della differenziazione e nella visualizzazione dei componenti cellulari e dei marcatori di differenziazione attraverso la microscopia a fluorescenza per confermare il successo della differenziazione cellulare.

Protocollo

1. Mantenere l'Auto-Rinnovamento nelle Cellule IMOP

1. Preparare i terreni di coltura iMOP: DMEM/F12, 1 integratore di B27, 25 μg/ml di carbenicillina e 20 ng/ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF). Preparare 50 ml di terreno di coltura iMOP utilizzando reagenti sterili. Riscaldare 49 ml di DMEM/F12 in un conico da 50 ml a bagnomaria a 37 °C.
   1. Scongelare l'integratore 50X B27 e sterilizzare con filtro 100 mg/ml di aliquote di carbenicillina per 5 minuti a bagnomaria a 37 °C. Scongelare 100 μg/ml di aliquota di bFGF a RT. Aggiungere 1 ml di 50X B27, 10 μl di 100 μg/ml di bFGF e 12,5 μl di 100 mg/ml di carbenicillina in DMEM/F12.
2. Utilizzare 3 ml di terreno in una piastra di coltura tissutale da 60 mm per la coltura di cellule iMOP. Aggiungi nuovi contenuti multimediali alle culture a giorni alterni raddoppiando il volume dei contenuti multimediali. Assicurarsi che la concentrazione di bFGF non scenda al di sotto di 5 ng/ml.
   1. Coltura di cellule iMOP a 37 °C con CO 2 al 5%. Passaggio delle cellule in coltura dopo 5 - 7 giorni_, come elencato nei passaggi seguenti. Trasferire la coltura in un conico da 15 ml utilizzando un puntale per pipetta da 10 ml.
3. Preparare 1 mM di EDTA in HBSS diluendo 0,1 ml di 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml di HBSS. Preriscaldare 1 mM EDTA prodotto in HBSS in un bagno d'acqua a 37 °C.
4. Raccogliere le celle per sedimentazione per gravità o centrifugazione a 200 x g per 5 minuti a RT. Per la sedimentazione per gravità, posizionare il conico da 15 ml contenente le colture nell'incubatore a 37 °C per 5 - 10 minuti. Trascorso questo tempo, osservare le otosfere raccogliersi sul fondo del 15 ml di conical.
   nota: Una forza centrifuga eccessiva può causare danni alle celle.
5. Aspirare con cura il terreno esaurito utilizzando una pipetta di aspirazione da 2 ml senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere 0,5 ml di soluzione preriscaldata di EDTA HBSS da 1 mM al pellet cellulare. Utilizzando una pipetta P1000, pipettare delicatamente su e giù 2 - 3 volte. Posizionare il conico a 37 °C e incubare per <5 minuti per facilitare la dissociazione in singole cellule.
6. Agitare delicatamente la soluzione cellulare per determinare se le otosfere sono dissociate. Se nessuna otosfera sedimenta sul fondo della conica, le cellule si dissociano. Il tempo di incubazione può variare.
   nota: L'incubazione prolungata con EDTA provocherà un'eccessiva morte cellulare.
7. Rimuovere le cellule a 37 °C, aggiungere 2 ml di terreno per neutralizzare e diluire l'EDTA. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 200 x g per 5 minuti a RT. Aspirare l'EDTA diluito utilizzando una pipetta aspirante da 2 ml e aggiungere 5 ml di 1X PBS per lavare le cellule.
8. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT e aspirare 1X PBS utilizzando una pipetta aspirante da 2 ml. Risospendere le cellule utilizzando una pipetta P1000 in 0,5 ml di terreno di coltura iMOP pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte.
9. Contare le cellule utilizzando un contatore di particelle microfluidico con le cassette appropriate. Una piastra confluente di celle iMOP conterrà ~6 celle X10⁶. Diluire le cellule 1:100 in terreno e aggiungere 75 μl di soluzione cellulare nella cassetta per il conteggio. Piastra 1 x 10⁶ cellule in un piatto da 6 cm in terreno di coltura iMOP (diluizione ~1:10). Passaggio iMOP ogni 5 - 7 giorni.
   nota: Le cellule che formano grandi otosfere o si attaccano al fondo della piastra di coltura tissutale si differenzieranno. Le cellule moriranno anche se le colture sono troppo confluenti.

2. Differenziare le cellule IMOP in epiteli sensoriali

1. Preparare 50 ml di terreni di differenziazione degli epiteli sensoriali iMOP: DMEM/F12, 1X integratore di B27, 25 μg/ml di carbenicillina. Preparare 50 ml di terreno di differenziazione degli epiteli sensoriali iMOP. Riscaldare 49 ml di DMEM/F12 in un conico da 50 ml a bagnomaria a 37 °C. Scongelare 50 volte l'integratore di B27 e 100 mg/ml di aliquote di carbenicillina per 5 minuti a bagnomaria a 37 °C. Aggiungere 1 ml di 50X B27 e 12,5 μl di 100 mg/ml di carbenicillina in DMEM/F12.
2. Per raccogliere, dissociare, risospendere e contare le cellule, ripetere i passaggi 1.4-1.9
3. Piastra 1 x 10⁶ cellule in una piastra di 6 cm al giorno -3 utilizzando terreni di coltura iMOP. Il giorno 0, trasferire le colture utilizzando una pipetta da 10 ml in una conica da 15 ml. Raccogliere le otosfere per sedimentazione per gravità, come indicato nel passaggio 1.6. Aspirare il terreno esausto utilizzando una pipetta aspirante da 2 ml e lasciare le otosfere sul fondo della conica.
4. Aggiungere delicatamente 2 ml di terreno di differenziazione degli epiteli sensoriali. Trasferire le otosfere in una piastra da 6 cm utilizzando una pipetta da 10 ml di foro largo.
   nota: Il taglio meccanico dovuto a un pipettaggio aggressivo può dissociare le cellule dalle otosfere.
5. Aggiungere 2 ml di terreni di differenziazione epiteliale sensoriale freschi alle colture a giorni alterni. Se necessario, le cellule possono essere raccolte mediante sedimentazione per gravità e sostituite con i mezzi.
6. Raccogliere le otosfere al giorno 10 trasferendole in un conico da 15 ml e lasciando sedimentare le otosfere come indicato al punto 1.6. Aspirare il terreno esaurito utilizzando una pipetta di aspirazione da 2 ml e lasciare indisturbate le otosfere.
7. Fissare le otosfere incubando in formaldeide al 4% in 1X PBS per 15 minuti a RT. Rimuovere la soluzione di formaldeide e lavare le otosfere con un tampone di lavaggio (1X PBS contenente lo 0,1% di TritonX-100) prima di incubarle in un tampone bloccante (1X PBS contenente il 10% di siero di capra normale e lo 0,1% di Triton X-100) per 1 ora.
   1. Sostituire il tampone e incubare i campioni nel tampone di blocco con anticorpo diluito. Incubare a 4 °C. Lavare i campioni con 1X PBS contenente lo 0,1% di Triton X-100 e sottoporre l'otosfera a immunocolorazione. Trasferire le otosfere in 1X PBS e posizionare le otosfere nel terreno di montaggio su un vetrino utilizzando una pipetta P1000. Applicare un vetrino coprioggetti sul campione e lasciare asciugare il terreno di montaggio a 4 °C.
8. Acquisizione di immagini di epifluorescenza utilizzando una configurazione di microscopio invertito dotata di una telecamera CCD a 16 bit e di un obiettivo a immersione in olio 20X 0,75 ad aria o 40X 1,3 NA. Raccogli la fluorescenza da diversi canali di colore utilizzando le lunghezze d'onda elencate (eccitazione ed emissione): blu (377 ± 25 nm/447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm/540 ± 25 nm), rosso (562 ± 20 nm/ e 625 ± 20 nm) e infrarosso (628 ± 20 nm/ e 692 ± 20 nm).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrino coprioggetti in vetro spessore 1,5 (rotondo 12 mm)	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 72230-01
DMEM/F12	Tecnologie per la vita	Codice 11320-082
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4	Tecnologie per la vita	Codice 10010-023
salina bilanciata di Hank (HBSS)	Tecnologie per la vita	Codice 14025-092
Integratore B27 (50X) Senza Siero	Tecnologie per la vita	Codice 17504-044	Conservato in aliquote da 1 ml
Prolong Gold Antifade Mountant	Tecnologie per la vita	Codice 47743-736	Conservato in aliquote da 10 mg/ml 100 μl
Moxi Z Mini Contatore di celle automatizzato	Orflo	MXZ001
Moxi Z Cassetta Tipo S	Orflo	MXC002
Fattore di crescita dei fibroblasti murini ricombinante, basico (bFGF)	Peprotech	450-33	Risospeso in BSA allo 0,1% in H20 e conservato in aliquote da 20 mg/ml
Carbenicillina, sale disodico	Thermo Fisher Scientifico	BP2648-1	Risospeso in 10mM Hepes pH 7,4 e conservato in aliquote da 100 mg/ml
Pipetta da 5 ml in brossura confezionata singolarmente (200/confezione)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 1367811D
10 ml di pipetta in brossura confezionata singolarmente (200/confezione)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 1367811E
Piatto da 6 cm trattato con coltura tissutale	Thermo Fisher Scientifico	130181
TipOne puntali per pipette con filtro filtrante 0,1-10 ul allungato	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1120-3810
TipOne puntali per pipette con filtro 1-20 ul	Stati Uniti d'America Scientific	1120-1810
TipOne puntali per pipette con filtro 1-200 ul	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1120-8810
TipOne puntali per pipette con filtro 101-1000 ul	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1126-7810
Provette coniche da 15 ml sterili 20 buste da 25 provette (500 provette)	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1475-0511
Provette coniche da 50 ml sterili 20 buste da 25 provette (500 provette)	Stati Uniti d'America Scientific	Codice: 1500-1211