Differenziazione di progenitori otici multipotenti immortalizzati in neuroni gangliari a spirale e valutazione della differenziazione

Abstract

Fonte: Azadeh, J., et al. Inizio della differenziazione in cellule progenitrici otiche multipotenti immortalizzate. J. Vis. Exp. (2016).

Il video dimostra la differenziazione dei progenitori otici multipotenti immortalizzati (iMOP) in neuroni gangliari spirali (SGN) e la conferma della differenziazione basata sull'immunofluorescenza. Gli iMOP vengono placcati su vetrini coprioggetti rivestiti con substrato di coltura in un terreno di differenziazione neuronale per la differenziazione in SGN. Le cellule differenziate vengono marcate con anticorpi specifici per i marcatori di differenziazione neuronale e analizzate al microscopio per confermare la differenziazione.

Protocollo

1. Differenziare i Neuroni Derivati da iMOP

1. Preparare 50 ml di terreni di differenziazione neuronale: terreni neurobasali, 1X integratore di B27, 2 mM di L-Glutammina. Scongelare il flacone di 50X B27 e 200 mM di L-Glutammina a bagnomaria a 37 °C per 5 min. Aggiungere 1 ml di 50X B27 e 0,5 ml di 200 mM di L-Glutammina a 48,5 ml di terreno neurobasale.
2. Rivestire il vetrino coprioggetto posizionando vetrini coprioggetto rotondi da 12 mm in una piastra sterile da 10 cm e aggiungere etanolo al 70% (EtOH) alla piastra per sterilizzare e pulire i vetrini.
3. Agitare delicatamente i vetrini coprioggetti per assicurarsi che siano ricoperti di etanolo. Lasciare la piastra per 10 minuti a RT. Sciacquare i vetrini coprioggetti 3 volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) sterile 1X per lavare via l'etanolo rimanente. Sciacquare una volta il vetrino coprioggetti con H₂O sterile per lavare via il rimanente 1X PBS.
4. Aspirare l'H₂O con una pipetta aspirante da 2 ml e lasciare asciugare i vetrini. Esporre i vetrini coprioggetti alla luce UV nel cappuccio di coltura tissutale per 15 minuti. Conservare i vetrini coprioggetti in un ambiente sterile se non utilizzati immediatamente.
5. Posizionare un vetrino coprioggetti rotondo da 12 mm in ogni pozzetto di una capsula da 24 pozzetti. Agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che i vetrini coprioggetti siano piatti sul fondo del pozzetto.
6. Scongelare 2 mg/ml di soluzione madre di poli-D-lisina a temperatura ambiente (RT) e diluire a una concentrazione di 10 μg/ml di poli-D-lisina in 1X PBS. Aggiungere 0,25 ml di poli-D-lisina 10 ug/ml nei pozzetti. Lasciare la piastra nell'incubatore a 37 °C per 1 ora.
7. Lavare i pozzetti 3 volte con 1X PBS sterile. Scongelare 10 mg/ml di soluzione madre di laminina a RT e diluire a 10 μg/ml in 1X PBS. Aggiungere 0,25 ml di soluzione di lavoro di laminina da 10 μg/ml in un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C dell'incubatore. Aspirare la soluzione di laminina utilizzando una pipetta aspirante da 2 ml.
8. Lavare il vetrino coprioggetti 3 volte con 1X PBS aggiungendo 1 ml di 1X PBS con una pipetta P1000 e rimuovendo 1X PBS aspirando con una pipetta aspirante da 2 ml. Lasciare 1X PBS dall'ultimo lavaggio nel pozzetto fino a quando le celle non sono pronte per essere placcate. Avviare la differenziazione neuronale raccogliendo, dissociando e contando le cellule. Piastra 1 x 10⁶ celle in un piatto da 6 cm al giorno -3.
9. Il giorno 0, raccogliere, dissociare e contare le cellule. Seminare 1 x 10⁵ - 1,5 x 10⁵ cellule iMOP in 0,5 ml di terreno di differenziazione neuronale preriscaldato per pozzetto in un piatto a 24 pozzetti. Aspirare e aggiungere terreni di differenziazione neuronale preriscaldati alle colture a giorni alterni.
10. Fissare i neuroni derivati da iMOP in formaldeide al 4% per 15 minuti a RT il giorno 7. Rimuovere la soluzione di formaldeide, lavare i neuroni derivati da iMOP con un tampone di lavaggio (1X PBS contenente lo 0,1% di TritonX-100) prima di incubare nel tampone bloccante (1X PBS contenente il 10% di siero di capra normale e lo 0,1% di Triton X-100) per 1 ora.
    1. Sostituire il tampone e incubare i campioni nel tampone di blocco con anticorpo diluito. Incubare a 4 °C. Lavare i campioni con 1X PBS contenente lo 0,1% di Triton X-100 e sottoporre le cellule all'immunocolorazione. Lavare il vetro di copertura con 1X PBS prima di posizionarlo sul supporto di montaggio. Lasciare asciugare il supporto di montaggio a 4 °C prima di acquisire immagini di epifluorescenza.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrino coprioggetti in vetro spessore 1,5 (rotondo 12 mm)	Scienze della microscopia elettronica 7	Codice: 72230-01
DMEM/F12	Tecnologie per la vita	Codice 11320-082
Terreno neurobasale	Tecnologie per la vita	Codice 21103
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4	Tecnologie per la vita	Codice 10010-023
Integratore B27 (50X) Senza Siero	Tecnologie per la vita	Codice 17504-044	Conservato in aliquote da 1 ml
L-Glutammina (200 mM)	Tecnologie per la vita	Codice 25030-081	Conservato in aliquote da 5 ml
Laminina di topo naturale	Tecnologie per la vita	Codice 23017-015	Conservato come aliquote da 1 mg/ml
Prolong Gold Antifade Mountant	Tecnologie per la vita	Codice 47743-736	Conservato in aliquote da 10 mg/ml 100 μl
Moxi Z Mini Contatore di celle automatizzato	Orflo	MXZ001
Moxi Z Cassetta Tipo S	Orflo	MXC002
Poli-D-lisina	sigma	P7886	Risospeso in 1X PBS e conservato in aliquote da 10 mg/ml 100 μl
Pipetta da 5 ml in brossura confezionata singolarmente (200/confezione)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 1367811D
10 ml di pipetta in brossura confezionata singolarmente (200/confezione)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 1367811E
Piastra Biolite a 24 pozzetti trattata per coltura tissutale	Thermo Fisher Scientifico	130188
Piastra a 6 pozzetti Biolite trattata per coltura tissutale	Thermo Fisher Scientifico	130184
Piatto da 6 cm trattato con coltura tissutale	Thermo Fisher Scientifico	130181
EMD Millipore Millex Siringa Sterile Filtro in PVDF Dimensione dei pori: 0,22 μm	Thermo Fisher Scientifico	SLGV033RS
Puntali per pipette con filtro TipOne 0,1 - 10 μl	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1120-3810
Puntali per pipette con filtro TipOne 1 - 20 μl	Stati Uniti d'America Scientific	1120-1810
TipOne puntali per pipette con filtro da 1 - 200 μl	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1120-8810
Puntali per pipette con filtro TipOne 101 - 1000 μl	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1126-7810
Provette coniche da 15 ml sterili 20 buste da 25 provette (500 provette)	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1475-0511
Provette coniche da 50 ml sterili 20 buste da 25 provette (500 provette)	Stati Uniti d'America Scientific	Codice: 1500-1211