Tutte le procedure del modello animale sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e il comitato di revisione veterinaria di JoVE ha esaminato tutte le procedure del modello animale.
1. Accoppiamenti a tempo
- Luogo ISLMN:GFP (proteina fluorescente verde del motoneurone delle isole; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Codice : 017952) topi maschio e femmina insieme durante la notte. Pesare le femmine e registrare i pesi prima dell'accoppiamento.
NOTA: ISLMN:GFP etichetta specificamente i motoneuroni con una GFP farnesilata che non è citotossica, si localizza nella membrana cellulare dei motoneuroni e dei loro assoni e consente ai nervi di essere visualizzati durante lo sviluppo. Potrebbero essere utilizzate anche altre linee marcate in fluorescenza.
- Controlla la presenza di tappi vaginali al mattino presto. La data di identificazione di una spina è indicata come E0.5.
- Confermare la gravidanza utilizzando l'aumento di peso e/o l'ecografia al giorno embrionale 10.5 (E10.5). Le madri gravide dovrebbero aver guadagnato almeno 1 g. Gli embrioni possono essere visti all'ecografia a E10.5.
2. Preparazione dei reagenti e del vibratomo per la coltura a fette
- Preparare 500 ml di tampone per affettare: aggiungere 5 ml di HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfofonico) e 5 ml di penicillina/streptomicina a 500 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) senza Ca2+ e Mg2+. Raffreddare a 4 °C.
nota: Il tampone di affettamento aggiuntivo deve essere conservato a 4 °C e può essere utilizzato per futuri esperimenti di coltura a fette.
- Preparare 50 mL di terreno di coltura: In una cappa sterile, aggiungere 12,5 mL di HBSS, 12,5 mL di siero fetale bovino (FBS), 250 μL di glucosio, 250 μL di L-glutammina, 125 μL di HEPES a 24,4 mL di Fluorobright DMEM (terreno Eagle modificato di Dulbecco). (Concentrazioni finali: FlouroBright DMEM con 25% di HBSS, 25% di FBS, 0,5% di glucosio, 1 mM di glutammina e 2,5 mM di HEPES). Riscaldare il terreno di coltura a 37 °C in un bagno d'acqua sterile.
nota: I terreni di coltura possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
- In una cappa sterile, aggiungere 1,5 mL di terreno di coltura a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere un inserto per colture cellulari (Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto. Porre in un'incubatrice sterile a 37 °C e 5% di CO2.
- Preparare agarosio a bassa temperatura di fusione al 4%: sciogliere 2 g di agarosio a bassa temperatura di fusione in 50 mL di PBS sterile. Microonde a intervalli di 30-60 s fino a completa dissoluzione. Mettere a bagnomaria a 40 °C per mantenere il liquido.
nota: L'agarosio extra può essere conservato a temperatura ambiente (RT) e sciolto per futuri esperimenti di coltura a fette.
- Imposta il vibratomo: posiziona una nuova lama sul vibratomo. Controllare le impostazioni: spessore 400-450 μm. Pre-raffreddare il vibratomo stage. Metti del ghiaccio nella camera esterna. Utilizzare una camera e un palco dedicati alle fette vive. Non utilizzare la stessa camera del vibratomo per il tessuto fissato poiché il fissativo residuo potrebbe danneggiare le fette.
- Preparare l'incubatore del tavolino del microscopio a 37 °C e 5% di CO2.
- Preparazione per la dissezione: pulire gli strumenti chirurgici e spruzzare con etanolo al 70%. Riempire due piastre di Petri con HBSS e metterle sul ghiaccio. Aprire una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti e posizionare il coperchio sul ghiaccio con la parte inferiore rivolta verso l'alto. Aprire una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti e posizionare gli inserti della membrana per colture cellulari e 1,5 mL di terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto. Preriscaldare la piastra in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
3. Raccolta di embrioni E10.5 e preparazione delle fette
NOTA: Tutti i passaggi da questo punto dovrebbero essere eseguiti il più rapidamente possibile. Mantieni sempre gli embrioni in ghiaccio.
- Eutanasia della madre gravida (E10.5) in una camera di CO2. Eseguire la lussazione cervicale.
- Spruzzare l'addome con etanolo al 70%. Tagliare l'addome con le forbici, rimuovere l'utero e metterlo in una capsula di Petri con HBSS ghiacciato per lavare via rapidamente il sangue. Sposta l'utero lavato su un secondo Petri riempito con piatto HBSS ghiacciato.
- Sotto un cannocchiale da dissezione, rimuovere gli embrioni dal corno uterino e dalle singole sacche amniotiche. Posizionare gli embrioni sul lato inferiore del coperchio di una piastra a 12 pozzetti. Mantenere il ghiaccio.
- Sotto un cannocchiale da dissezione, utilizzare carta da filtro per rimuovere il liquido che circonda ogni embrione.
nota: Gli embrioni si attaccheranno alla carta da filtro se toccati.
- Incorporare gli embrioni nell'agarosio. Versare l'agarosio fuso su ogni embrione fino a coprirlo. Mantenere il ghiaccio. Non appena l'agarosio si è indurito, capovolgere ogni embrione e versare altro agarosio sull'altro lato. Mantenere il ghiaccio.
- Utilizzando un cannocchiale da dissezione fluorescente, taglia l'agarosio attorno a ciascun embrione in modo che sia orientato correttamente quando incollato allo stadio del vibratomo. Il nucleo oculomotore e la crescita precoce degli assoni sono fluorescenti. Allineare l'embrione in modo che il nucleo, gli assoni in uscita e l'occhio formino una linea e tagliare l'agarosio con una lama di rasoio tagliata parallelamente a questa linea (dorsale all'embrione, vedere Figura 1A).
nota: Questo sarà il lato incollato allo stadio del vibratomo (l'embrione sarà posizionato sulla schiena, la testa più vicina alla lama del vibratomo). Una linea tra il nucleo oculomotore e l'occhio dovrebbe essere parallela alla lama del vibratomo.
- Riempire la camera del vibratomo con un tampone di fette ghiacciato. Superincollare l'embrione allo stadio di vibratomo in modo che la lama sia parallela al nucleo oculomotore e agli occhi. Una volta che la supercolla è asciutta, immergere lo stadio del vibratomo in modo che l'embrione sia orientato verso l'esterno della lama.
- Affettare fette da 400-450 μm. Raccogliere ogni fetta con una pipetta di trasferimento sterile. Mettere nel tampone per affettare a freddo.
- Sotto l'oscilloscopio di dissezione, scegliere la fetta contenente i nuclei oculomotori e gli occhi. Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, posizionarla sull'inserto di coltura cellulare nella piastra a 6 pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C. In alternativa, chiedi a una persona di affettare e a un'altra di posizionare le fette. Ridurre al minimo il tempo tra l'affettatura e il posizionamento nell'incubatrice.
nota: Le fette devono essere orientate in modo tale che la fluorescenza massima emessa dai nuclei e dagli assoni sia il più vicino possibile all'obiettivo del microscopio per immagini. Su un microscopio invertito, le fette devono essere posizionate sulla membrana con i nuclei e gli assoni più vicini all'obiettivo sotto la piastra.
- Rimuovere l'agarosio residuo dallo stadio del vibratomo, incollare l'embrione successivo allo stadio e ripetere i passaggi 3.7-3.9 fino a quando tutti gli embrioni sono stati affettati e placcati.
- Aggiungere l'inibitore o la molecola ricombinante di scelta ai terreni in ciascun pozzetto per creare una curva dose-risposta. Diluire in solvente appropriato.
nota: Se si utilizza il dimetilsolfossido (DMSO), utilizzare solo DMSO per colture tissutali. In alternativa, le perle a rilascio di proteine possono essere posizionate in punti specifici della fetta.
- Posizionare sul microscopio nella camera a 37 °C e CO2 al 5%. Impostare il microscopio in modo che scatti fotografie a contrasto di fase e fluorescenti di ciascuna fetta ogni 30 minuti (o più spesso se lo si desidera). Le fette possono essere mantenute per 48-72 ore.
