Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione di strumenti, soluzioni e supporti
Nota: Tutte le informazioni su materiali, reagenti, strumenti e strumenti riportati nel protocollo sono specificate nella Tabella dei Materiali.
- Autoclavare tutti gli strumenti di dissezione in autoclave e conservarli in un'area sterile. Utilizzare i seguenti strumenti: 4 pinze standard (2 lunghe e 2 corte) e 2 forbici, oltre a 2 pinze (1 lunga e 1 corta) e 1 forbice per la dissezione; Conserva un set extra come backup.
- Preparare 100 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS)/siero fetale bovino (FBS) all'1% da utilizzare durante i lavaggi, le procedure di immunomarcatura e le fasi di selezione cellulare. Conservare la soluzione in frigorifero a 4 °C.
nota: Non aggiungere sodio azide (NaN3) alla soluzione, poiché può essere tossico per le cellule vive.
- Preparare 100 ml di PBS/1% FBS con 99 ml di PBS e 1 ml di FBS.
- Preparare 100 mL di terreno di coltura neurale sterile integrato con il 3% di FBS (vedere la Tabella dei materiali) da utilizzare come terreno di raccolta e coltura. Mantenere sterile il terreno di coltura cellulare a 4 °C. Riscaldarlo solo a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
- Preparare 100 ml di terreno di cellule neurali integrato con il 3% di FBS utilizzando 97 ml di terreno di cellule neurali e 3 ml di FBS.
- Pre-raffreddare le provette di raccolta (provette da 15 mL) pre-rivestite con 5 mL di terreno di raccolta mettendole in un secchiello per il ghiaccio. Utilizzare solo provette in polipropilene per evitare che le celle aderiscano alla superficie della provetta.
- Posizionare nell'armadio di biosicurezza piatti da 40 mm, filtri in nylon da 70 μm, siringhe, pestelli per il filtro cellulare e provette sterili in polipropilene. Sterilizzare tutti gli articoli prima delle procedure e mantenerli in modo sterile durante le procedure.
nota: Tutte le fasi successive alla raccolta delle retine saranno eseguite nella cabina di biosicurezza.
2. Preparazione della sospensione cellulare retinica
- Posizionare l'occhio raccolto sulla piastra di base di un microscopio da dissezione per iniziare la dissezione corneale. Sezionare ogni occhio singolarmente.
- Tenere con cura il globo alla base del nervo ottico usando una pinza. Per questo passaggio, utilizzare una pinza standard lunga e una corta.
- Utilizzare un ago affilato calibro 30 (30G) per perforare la cornea. Ciò consentirà all'umore acqueo di evacuare dall'occhio, rendendo più facile tenere l'occhio con il forcipe.
- Tenere la cornea con la pinza e usare le forbici per praticare una piccola incisione nella cornea. Sbucciare delicatamente la cornea e la sclera usando la pinza. Quando il globo è staccato a metà, arrotolare la retina e il cristallino usando la pinza. Scartare la cornea, la sclera e la lente.
nota: Questo metodo assicura che la retina si stacchi completamente dal resto dell'occhio.
- Posizionare la retina in una piccola capsula di Petri da 40 mm contenente PBS/1% FBS.
nota: In alternativa alla capsula di Petri, è possibile utilizzare una piastra per colture cellulari. Assicurati di mantenere sempre umida la retina, come in condizioni fisiologiche.
- Lavare ogni retina tre volte con PBS sterile/FBS all'1% all'interno della cabina di biosicurezza.
- Posizionare fino a 12 retine su un colino di nylon sterile da 70 μm inumidito con PBS/1% FBS. Utilizzando l'estremità posteriore di una siringa da 10 ml, macerare delicatamente le retine con un movimento circolare per staccare le cellule.
- In alternativa, utilizzare un pestello per la macerazione del filtro cellulare o utilizzare la digestione enzimatica con una combinazione di 15 UI/mL di papaina, 5 mM di L-cisteina e 200 U/mL di DNasi I per 15 minuti a 37 °C, seguita da inattivazione con PBS/10% FBS.
nota: Non sono stati osservati cambiamenti nella percentuale di cellule recuperate quando la digestione enzimatica è stata confrontata con la macerazione con l'estremità posteriore della siringa o del pestello.
- Per trasferire le cellule isolate, posizionare il filtro sterile in nylon da 70 μm sopra la provetta di raccolta in polipropilene. Passare le cellule raccolte attraverso il colino utilizzando una pipetta P1000. Sciacquare il colino (passaggio 3.6) con PBS/1% FBS per rilasciare le cellule rimanenti e trasferirle nella provetta di raccolta.
- Aggiungere PBS/1% FBS per ottenere un volume finale di 1 mL per retina. Centrifugare la sospensione cellulare per 7 minuti a 200 x g e RT.
Nota: A seconda del numero di retine macerate (< 6 retine), il pellet cellulare potrebbe essere troppo piccolo per essere visibile.
- Scartare il surnatante cellulare e risospendere il pellet cellulare in PBS/1% FBS utilizzando un rapporto di 1 mL per 5 retine.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Pulire un emocitometro di vetro e un vetrino coprioggetti con alcool al 70%. Agitare delicatamente il tubo contenente le cellule per assicurarsi che la sospensione cellulare della retina sia distribuita uniformemente. Mettere 20 μl di blu di tripano allo 0,4% in una provetta da microcentrifuga e mescolare con 20 μl di sospensione cellulare.
- Mescolare delicatamente e applicare 10 μl della miscela di sospensione di blu di tripano/cellule allo 0,4% sull'emocitometro, riempiendo entrambe le camere; l'azione capillare attirerà la miscela di sospensione di blu di tripano/cellule allo 0,4% sotto il vetrino coprioggetti. Usando un microscopio, conta tutte le cellule blu di tripano negative; Questo numero rappresenta le cellule vive.
- Determinare la vitalità cellulare utilizzando la seguente formula: conta delle cellule vive / conta totale delle cellule = % vitalità.
nota: Se la vitalità delle cellule è inferiore al 95%, è necessario un colorante fluorescente per discriminare la vitalità cellulare durante la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).
- Utilizzare un colorante fluorescente per la vitalità che non sia adatto alle cellule vive. Lavare le cellule con PBS per rimuovere ogni traccia di siero. Aggiungere 1 μl di colorante fluorescente per la discriminazione della vitalità cellulare per 5,0 x 106 cellule in un volume finale di 100 μl. Incubare a RT per 15 minuti, al riparo dalla luce. Aggiungi 10 volte il volume di PBS/1% FBS. Centrifugare per 5 min a 200 x g e RT.
- Se necessario, incubare la sospensione cellulare per una notte a 4 °C. In tal caso, riempire il tubo di sospensione cellulare con mezzo cellulare neurale anziché PBS/FBS all'1%. Posizionare il tubo orizzontalmente e mantenerlo a 4 °C.
3. Immunomarcatura delle cellule retiniche
- Utilizzare la seguente conversione per determinare il volume di anticorpi per numero di cellule: 2 μl di anticorpo per 5,0 x 106 cellule in un volume di 100 μl.
- Lavare le celle e mantenerle in PBS/1% FBS. Prendi una piccola aliquota di celle (5,0 x 106 celle) da utilizzare come controllo negativo (non etichettato) al momento dell'ordinamento impostato.
nota: Questo controllo negativo è fondamentale per la corretta calibrazione del selezionatore di cellule.
- Per ridurre al minimo il legame non specifico degli anticorpi alle cellule che esprimono i recettori Fcγ II e III, aggiungere 1 μL di un anticorpo CD16/32 anti-topo per 1,0 x 106 cellule in un volume finale di 50 μL utilizzando PBS/1% FBS. Incubare per 10 minuti a RT.
- Aggiungere il cocktail di anticorpi al campione e mescolare delicatamente pipettando. Incubare per 30 minuti in un secchiello per il ghiaccio. Assicurarsi che il secchiello del ghiaccio sia coperto, poiché la luce potrebbe compromettere l'esperimento a causa del fotosbiancamento dei fluorofori etichettati.
- Preparare il cocktail di anticorpi utilizzando i seguenti anticorpi anti-topo marcati con fluorescenza: CD90.2 AF (Alexa fluor)-700, CD48 PE (Ficoeritrin)-Cianina7, CD15 PE e CD57.
Nota: per ciascun anticorpo, utilizzare le seguenti concentrazioni per 5,0 x 106 cellule: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Cianina7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; e CD57 non marcato, 0,4 μg.
- Utilizzare i volumi secondo i seguenti calcoli (basati sugli anticorpi disponibili in commercio elencati nella Tabella dei materiali): totale di 5,0 x 107 cellule da marcare; 2 μl per 5,0 x 106 cellule = 20 μl di ciascun anticorpo; 4 anticorpi diversi = 80 μl di cocktail di anticorpi; volume finale = [(5,0 x 107 cellule totali)/5,0 x 106 cellule] x 100 = 1.000 μL; 80 μL di Abs + 50 μL di CD16/32 anti-topo + 870 μL di PBS/1% FBS = 1.000 μL.
nota: Questa combinazione ha fornito la combinazione ottimale di fluorocromi per la configurazione dello strumento. I seguenti parametri riassumono l'emissione e l'eccitazione: AF-700, emissione di 719 nm quando eccitato con un laser a diodi rossi da 638 nm; PE-Cianina7, emissione di 767 nm quando eccitato con un laser a diodi blu da 488 nm; e PE, emissione di 575 nm quando eccitato con un laser a diodi blu da 488 nm.
- Dopo l'incubazione di 30 minuti, portare il volume fino a 5 mL utilizzando PBS/1% FBS. Lavare i campioni centrifugandoli per 7 minuti a 200 x g e RT. Ripetere la procedura una volta per rimuovere tutti gli anticorpi non legati.
- Aggiungere 2 μL di anticorpo secondario (0,1 μg), che legherà il CD57 di 5,0 x 106 cellule. Incubare per 30 minuti in un secchiello per il ghiaccio, come al punto 3.4. Lavare le celle due volte, come al punto 3.5.
- Etichettare le cellule con un anticorpo secondario se è stato utilizzato un anticorpo primario non marcato nella fase 3.4.
Nota: L'anticorpo secondario scelto per questa configurazione è elencato nella Tabella dei materiali; Ha una lunghezza d'onda di emissione di 421 nm. Utilizzalo con un filtro passa-banda di 450/50 nm quando eccitato con il laser a diodi viola a 405 nm.
- Utilizzare i volumi in base ai seguenti calcoli (basati sugli anticorpi disponibili in commercio elencati nella Tabella dei materiali): 2 μl per 5,0 x 106 cellule = 20 μl di anticorpo secondario; volume finale = [(5,0 x 107 cellule totali)/5,0 x 106 cellule] x 50 = 500 μl; 20 μl di Abs + 480 μl di PBS/1% FBS = 500 μl.
- Mantieni le celle etichettate in PBS/1% FBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro; utilizzare una concentrazione finale di cellule retiniche di 3,0 - 4,0 x 107 cellule/mL.
nota: Non utilizzare il terreno di coltura cellulare per diluire le cellule perché il rosso fenolo può aumentare l'autofluorescenza, riducendo così la risoluzione tra cellule negative e positive. La concentrazione finale di celle per volume dipende fortemente dalla portata volumetrica della configurazione dello strumento.
- Utilizzare i controlli monocolore durante la configurazione per ridurre al minimo la fuoriuscita della fluorescenza.
nota: Questo passaggio, noto anche come compensazione, viene applicato per correggere il rumore creato dalla combinazione di fluorofori. Le microsfere di polistirene in PBS/0,1% BSA/2 mM NaN3 con la capacità di legare isotipi di immunoglobuline (Ig) marcate in fluorescenza da più specie forniscono controlli positivi per impostare la compensazione.
- Mettere 3 gocce di microsfere di polistirene in provette FACS sterili, assegnandone una per fluoroforo. Aggiungere 1 μg del rispettivo fluoroforo a ciascuna provetta. Incubare per 15 minuti a RT, al riparo dalla luce. Aggiungere 3 mL di PBS/1% FBS alle provette del campione. Centrifugare per 5 minuti a 200 x g e RT. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere in 250 μl di PBS/1% FBS.
- Per impostare i controlli negativi, utilizzare microsfere di polistirene che non si legano alle Ig. Se necessario, eseguire questo passaggio il giorno prima.