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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
NOTA: In breve, i fibroblasti sono stati riprogrammati in iPSC tramite la riprogrammazione genetica basata su mRNA. Le iPSC sono state mantenute in terreno di coltura con cellule staminali (SCM) (vedi elenco dei materiali) e conservate a una densità di ~1,2 x 102 cellule/mL con 1 mL di SCM, 10 μM con l'inibitore della proteina chinasi rho-associata (ROCKi) Y-27632 e il 10% (v/v) di dimetilsolfuro (DMSO), in fiale crioconservate in azoto liquido a -160 °C. Tutte le seguenti procedure vengono eseguite in una cabina di biosicurezza, se non diversamente specificato.
1. Diluizione della matrice della membrana basale e rivestimento della piastra
- Matrice della membrana basale diluita (1:50) con fattore di crescita ridotto purificata dal tumore di Engelbreth-Holm-Swarm nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco senza rosso fenolo.
- Rivestire le piastre per colture cellulari con la quantità appropriata di matrice di membrana basale diluita (ad esempio, piastra a 6 pozzetti = 1 mL, piastra a 12 pozzetti = 0,5 mL) e incubare queste piastre a 37 °C per almeno 1 ora.
2. Mantenimento indotto di cellule staminali pluripotenti (iPSC)
NOTA: La confluenza massima per pozzetto in una piastra a fondo piatto a 6 pozzetti è ~1.2 x 106 celle.
- Scongelare le iPSC crioconservate in SCM con 10 μM di Y-27632 e su una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale a fattore di crescita ridotto diluito.
- Mantenere le iPSC in SCM con 10 μM di Y-27632 per le prime 24 ore dopo lo scongelamento. Passare al terreno fresco dopo 24 ore.
- Mantenere le iPSC nella SCM fino a quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza prima del passaggio.
- Calcolare quante iPSC saranno necessarie per la differenziazione moltiplicando la densità desiderata per la differenziazione (15.600 cellule/cm2) per l'area superficiale del pozzetto. Per una piastra a fondo piatto a 6 pozzetti, moltiplicare 15.600 cellule/cm2 per 9,6 cm2 per un totale di 149.760 cellule/pozzetto.
- Per il passaggio, lavare le celle con la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBBS). Quindi, incubare le cellule con acido etilendiamminotetraacetico non enzimatico (EDTA) (vedere l'elenco dei materiali) per 5 minuti a 37 °C.
- Usa un raschietto per sollevare delicatamente le cellule. Raccogli le cellule in SCM fresco.
- Piastra le cellule su piastre di coltura cellulare rivestite con SCM diluito e mantiene le cellule come descritto al punto 2.3 o conservale a ~1,2 x 106 cellule/mL in 1 mL di SCM, 10 μM di Y-27632 e 10% di DMSO (v/v) in fiale crioconservate in azoto liquido a una temperatura di -160 °C.
3. Differenziazione delle iPSC dalle BMEC
NOTA: L'EDTA non enzimatico separa le cellule in grumi. L'EDTA enzimatico (vedi Tabella dei materiali) separa le cellule in sospensioni a cellula singola. L'acido retinoico (RA) deve essere protetto dalla luce.
- Lavare le iPSC una volta con la soluzione salina tampone fosfato (DPBS) di Dulbecco. Incubare con EDTA enzimatico (1 mL per la piastra a 6 pozzetti, 0,5 mL per la piastra a 12 pozzetti e 0,25 mL per la piastra a 24 pozzetti) per circa 5 minuti a 37 °C per ottenere una sospensione a singola cellula.
- Raccogliere le celle e centrifugare a 300 x g (forza centrifuga relativa) per 5 minuti a temperatura ambiente. Pellet di cellule di risospensione in SCM contenenti 10 μM di Y-27632.
- Determinare la densità cellulare utilizzando Trypan Blue e un contatore di cellule automatizzato o un dispositivo emocitometro. Piastre di celle a una densità di 15.600 cellule/cm2 o 149.760 cellule/pozzetto di una piastra a fondo piatto a 6 pozzetti (con una superficie di 9,6 cm2/pozzetto) in SCM contenente 10 μM di Y-27632 per 24 ore.
- Avviare la differenziazione dopo 24 ore modificando SCM in E6 medium. Cambia E6 medium ogni giorno per i prossimi 4 giorni.
- Il giorno 4 di differenziazione, sostituire il terreno E6 con un terreno privo di siero endoteliale umano (hESFM) integrato con un integratore di B27 diluito (1:200), 20 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) e 10 μM di RA. Non cambiare questo supporto per le successive 48 ore.
- Preparare 200 mL di hESFM con B27 diluita (1:200), miscelare 1 mL di integratore B27 concentrato 50x con 199 mL di hESFM.
- Preparare 20 ng/mL di bFGF ricostituendo 50 μg di bFGF in 250 μL di tampone Tris (5 mM di Tris, pH 7,6, 150 mMcloruro di sodio, NaCl) per ottenere una soluzione madre di 200 μg/mL. Preparare 200 mL di hESFM contenenti 20 ng/mL di bFGF mescolando 20 μL di 200 μg/mL di bFGF con 200 mL di hESFM.
- Preparare 10 μM di AR preparando prima una soluzione madre di 40 mg/mL di AR aggiungendo 2,5 mL di DMSO a 100 mg di polvere di AR. Diluire questa concentrazione a 3 mg/mL per ottenere una soluzione madre da 10 mM. Preparare 200 mL di hESFM contenente 10 μM di AR mescolando 200 μL di 10μM di AR in 200 mL di hESFM.
4. Rivestimento della matrice di collagene IV (COL4) e fibronectina (FN) per la purificazione del BMEC derivato da iPSC
- Aggiungere 2 mL di acqua sterile a 2 mg di FN per ottenere una soluzione madre di 1 mg/mL di FN. Aggiungere 5 mL di acqua sterile a 5 mg di COL4 per ottenere una soluzione madre di COL4 da 1 mg/mL.
- Lasciare sciogliere FN per almeno 30 minuti a 37 °C e COL4 a temperatura ambiente.
- Diluire la soluzione madre di FN in acqua sterile a una concentrazione finale di 100 μg/mL e la soluzione madre di COL4 a una concentrazione finale di 400 μg/mL.
- Rivestire le piastre desiderate (piastra a 6 pozzetti = 1 mL di soluzione COL4/FN, piastra a 12 pozzetti = 0,5 mL, piastra a 24 pozzetti = 0,25 mL e piastra filtrata a 12 pozzetti = 0,25 mL) con la miscela di 400 μg/mL di COL4 e 100 μg/mL di FN.
- Incubare le piastre per un minimo di 2 ore o per una notte a 37°C; per le piastre filtrate Transwell, si consiglia un minimo di 4 ore.
5. Sottocoltura e purificazione di BMEC derivati da iPSC
NOTA: L'incubazione con EDTA enzimatico può richiedere più di 15 minuti a seconda della confluenza delle cellule al giorno 6 di differenziazione.
- Il giorno 6 di differenziazione, lavare le cellule due volte con DPBS. Incubare con 1 mL di EDTA enzimatico per almeno 15 minuti a 37°C fino ad ottenere una sospensione a singola cellula.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere i pellet cellulari con hESFM fresco con integratore di B27 diluito (1:200), 20 ng/mL di bFGF e 10 μM di RA.
- Cellule di semina su piastre rivestite con una miscela di 400 μg/mL di COL4 e 100 μg/mL di FN. Cellule di semina utilizzando un rapporto di 1 pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per 3 pozzetti di una piastra a 12 pozzetti, 3 pozzetti di una piastra filtrata a 12 pozzetti o 6 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.