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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Impostazione del materiale
- Incubare le uova di pollo in un'incubatrice da tavolo disponibile in commercio a 37 °C. Incubare le uova per 7 giorni per gli embrioni E7.
- Preparare array multi-elettrodo (MEA). Sterilizzare il numero richiesto di MEA immergendoli in etanolo al 70% per 3-4 ore e poi sciacquandoli tre volte in circa 10 ml di acqua distillata sterile nella cappa di livello di biosicurezza II (BSLII).
nota: I MEA contengono 64 elettrodi di platino nanoporosi disposti in una griglia 8 x 8. Il diametro dell'elettrodo è di 30 μm e la distanza tra gli elettrodi è di 200 μm. Non utilizzare etanolo denaturato per sterilizzare i MEA, poiché ciò porterebbe alla corrosione.
- Posizionare i MEA all'interno di un contenitore sterile con coperchio (per mantenere le condizioni di sterilità) e spostarli in un'incubatrice da tavolo. Infornare per almeno 6 ore a 55 °C. Questo passaggio è fondamentale per una corretta sterilizzazione e la temperatura non deve superare i 60 °C. Per mantenere la sterilità, spostare la capsula contenente MEA nella cappa BSLII per la conservazione fino a nuovo utilizzo.
nota: Utilizziamo una teglia in vetro adatta al forno con coperchio e superficie di plastica, la sterilizziamo con etanolo al 70% e la mettiamo nella cappa BSLII per l'asciugatura.
- Aliquotare la soluzione di matrice extracellulare (ECM). Scongelare il flaconcino a 4 °C per una notte e congelare 100 μL di aliquote a -20 °C.
nota: ECM viene spedito congelato. Non deve essere portato a temperatura ambiente fino al momento di essere rivestito poiché polimerizza a temperatura ambiente ed è impossibile da rivestire una volta polimerizzato. La MEC senza fattori di crescita è preferita per prevenire ulteriori effetti dovuti a fattori sconosciuti.
- Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione (pinze Dumont #5, pinze curve, forbici piccole e forbici a molla) e le piastre di dissezione rivestite di materiale autosigillante con etanolo al 70% e lasciarle asciugare nella cappa di dissezione.
2. Coltura di Neuroni Embrionali di Pulcino e Attività di Rete
- Il giorno della piastratura, rimuovere una fiala di ECM dal congelatore a -20 °C, spruzzare con etanolo al 70% e metterla sul ghiaccio. Diluire al 25% aggiungendo 300 μL di terreno neurobasale freddo all'interno della cappa BSLII.
- Utilizzando un pipettatore P200, aggiungere 100 μL di ECM al 25% al centro del MEA, facendo attenzione a non toccare gli elettrodi, e rimuoverli immediatamente, lasciando una pellicola sottile sulla superficie. Coprire il MEA e metterlo nell'incubatore di CO2 (37 ° C e 5% CO2 ) fino al momento di placcare i neuroni.
- Sterilizzare il guscio esterno di un uovo E7 (embrionale 7° giorno, incubato a 37 °C per 7 giorni) con etanolo al 70%. Decapitare l'embrione in una capsula di dissezione inferiore Sylgard contenente la soluzione sterile fredda di sali bilanciati di Hank (HBSS) senza calcio. Taglia intorno agli occhi e rimuovi i bulbi oculari. Utilizzando le pinze sottili DuMont #5 e le forbici a molla, praticare un'incisione sul lato ventrale e rimuovere gli strati esterni della pelle per esporre il proencefalo e il tectum ottico. Sbucciare e rimuovere con cura la membrana pial. Trasferite il proencefalo in un'altra capsula di Petri e tagliatelo a pezzetti di circa 2 mm con le forbici a molla.
nota: Non dovrebbero esserci vasi sanguigni attaccati al proencefalo dopo la rimozione della membrana piale. Se disponibile, è preferibile eseguire la dissezione in una cappa di dissezione sterile, anche se abbiamo ottenuto risultati abbastanza buoni quando la dissezione viene eseguita al di fuori di una cappa, purché gli strumenti e l'area di dissezione siano accuratamente sterilizzati con etanolo al 70%.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, raccogliere i pezzi di proencefalo in una provetta da centrifuga da 15 ml e rimuovere la maggior quantità possibile di HBSS dopo averli lasciati affondare sul fondo della provetta da centrifuga.
- Aggiungere 1 mL di tripsina/acido etilendiammina tetraacetico allo 0,05% (tripsina/EDTA) (preriscaldato a 37 °C) e incubare a 37 °C per 15 minuti.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere con cura la tripsina senza disturbare i pezzi di tessuto e aggiungere 1 mL di terreno neurobasale. Lascia che i pezzi di tessuto affondino sul fondo e rimuovi il terreno. Ripetere il lavaggio ancora una volta. Questo passaggio consiste nel lavare via la tripsina/EDTA.
- Aggiungere 2 mL di terreno neurobasale e iniziare a triturare. La triturazione consiste nel prendere una pipetta Pasteur sterile lucidata a fuoco e passare delicatamente il tessuto attraverso di essa più volte fino a quando non si vedono più pezzi. Se rimangono dei pezzi dopo ripetuti passaggi, lasciali depositarsi sul fondo.
nota: Evitare la formazione di schiuma durante la triturazione: se si forma schiuma, fermarla e rimuoverla per aspirazione.
- Diluire le cellule ri-sospese 1:10 con terreno neurobasale e contare le cellule vitali utilizzando il colorante Trypan Blue e un emocitometro. Miscelare 50 μl di cellule diluite con 50 μl di soluzione di Trypan Blue in una provetta da centrifuga da 0,5 mL. Aggiungere 10 μL all'ematocitometro dopo averlo posizionato sul vetrino coprioggetti e contare le cellule chiare e luminose (le cellule blu sono morte e non devono essere contate).
nota: Il numero tipico di cellule di un singolo tectum ottico E7 varia tra 1 e 5 x 107 cellule/mL.
- Piastra le cellule dissociate su MEA rivestite di ECM a una densità di 2.200 cellule/mm quadrato. Per il nostro sistema MEA, questo si traduce in circa 130.000 celle per MEA. Aggiungere il terreno neurobasale per portare il volume nel MEA a 1 mL e posizionare i MEA nell'incubatore di CO2 durante la notte per l'adesione delle cellule e l'estensione dei neuriti (Figura 1).
nota: Per MEA di diverse aree e numeri di elettrodi, si potrebbero provare diverse densità di cellule: in generale, una maggiore densità di celle si traduce in una maggiore attività della rete, ma porta anche a colture di vita più breve.
