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1. Generazione di cellule progenitrici neurali derivate da iPSC (iNPC)
- Produrre EZ-sfere da colonie di iPSC come descritto di seguito e come precedentemente pubblicato.
- Colture di colonie di iPSC per confluenza su piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice di membrana basale (0,5 mg/piastra) in mTESR1 o altri mezzi commerciali (vedi Tabella dei materiali).
- Rimuovere il terreno iPSC e sostituirlo con 2 mL di terreno EZ-sphere [ESM; DMEM:F12 7:3 integrato con 100 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF), 100 ng/mL di fattore di crescita epidermico, 5 μg/mL di eparina e 2% di integratore di B27].
- Raschiare il fondo di ciascun pozzetto confluente con il retro di un puntale per pipetta sterile da 1000 μl o di un raschietto cellulare.
- Raccogli tutte le cellule e mettile in un pallone T25 ad attacco ultra-basso per consentire la formazione spontanea di sfere fluttuanti. Incubare per una notte a 37 °C.
- Alimenta le sfere ogni 2-3 giorni quando il terreno diventa giallo sostituendo metà del terreno con ESM fresco. Ciò consente alle sfere di rimanere in un mezzo condizionato, che è molto importante per la loro crescita e manutenzione.
- Appoggiare il pallone su una rastrelliera per provette e lasciare che le sfere si depositino per gravità per 1-2 minuti fino all'angolo del pallone.
- Una volta depositato, aspirare metà del surnatante con una pipetta sierologica da 5 mL o 10 mL e sostituirla con ESM fresco e preriscaldato.
- Passaggio settimanale delle EZ-sfere tagliando le sfere a 200 μm di diametro come descritto in precedenza. Le EZ-sphere possono essere mantenute per un massimo di 25 passaggi e sono ideali se utilizzate tra i passaggi 8-25.
- Preparare la sospensione unicellulare di iNPC:
- Per indurre la differenziazione neurale, dissociare la sfera EZ in singole cellule.
- Raccogliere le sfere 3-4 giorni dopo il taglio da un pallone T75 e trasferirle in un conico da 15 ml, quindi lasciarlo riposare per 2 minuti o fino a quando tutte le sfere non si saranno depositate sul fondo.
- Rimuovere lentamente l'ESM con una pipetta da 5 mL senza rompere le sfere depositate. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione (vedere la Tabella dei materiali) e incubare per 10 minuti a 37 °C.
- Agitare la soluzione di dissociazione e le sfere dopo 5 minuti di incubazione per assicurarsi che le sfere depositate vengano trattate.
- Rimuovere lentamente la soluzione di dissociazione. Aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione neurale [NDM; DMEM: F12 con il 2% di B27 meno la vitamina A, l'1% di integratore di N2 e fattore neurotrofico derivato dal cervello umano (hBDNF, 20 ng/mL)].
- Triturare le sfere in singole cellule pipettandole con una pipetta da 1 ml seguita da una pipetta da 200 μl, fino a quando tutte le sfere non si sono dissociate. Evitare la formazione di bolle durante la procedura di triturazione.
- Contare le cellule dissociate utilizzando un emocitometro e diluire le cellule fino a una densità finale di 1 x 106 cellule/mL. È possibile modificare la densità a seconda dell'applicazione.
nota: Densità più elevate (fino a 6 x 106 cellule/mL) sono raccomandate per colture a breve termine fino a 3 giorni, mentre densità più basse sono raccomandate per applicazioni a lungo termine fino a 3 settimane.
nota: Le cellule sono ora pronte per essere seminate nel canale superiore del chip per formare il "lato cervello".
2. Differenziazione delle iPSC in iBMEC
- Passaggio di iPSC da un singolo pozzetto confluente di una piastra a 6 pozzetti con un rapporto 1:6 in una piastra rivestita con matrice a membrana basale a 6 pozzetti. Lasciare aderire le cellule per 24 ore. Cambiare il mezzo iPSC ogni giorno.
- Contare le cellule ogni giorno utilizzando un emocitometro.
- Quando le cellule raggiungono una densità di 1,5-3,0 x 105 cellule/pozzetto, sostituire il terreno iPSC con 3 mL di terreno non condizionato senza bFGF [DMEM:F12 1:1, con il 10% di sostituzione del siero knockout (KOSR), l'1% di aminoacidi non essenziali (NEAA), lo 0,5% di integratore di glutammina (Tabella dei materiali) e 100 μM di β-mercaptoetanolo]. Sostituire il fluido ogni giorno per 6 giorni.
- Al giorno 6, sostituire il terreno con un terreno a cellule endoteliali (EC) [terreno libero da siero endoteliale umano (hESFM) integrato con siero bovino plasmaderivato povero di piastrine all'1%, 20 ng/mL di bFGF e 10 μM di acido retinoico all-trans (RA)]. Lasciare agire a temperatura media per 2 giorni.
- Rimuovere il terreno EC e aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione per pozzetto. Incubare a 37 °C per 35 min.
nota: Sebbene questo sia considerato un lungo tempo di incubazione nella soluzione di dissociazione qui utilizzata, gli iBMEC possono sopportare questo trattamento con una vitalità cellulare superiore al 90%.
- Staccare le cellule dal pozzetto pipettando delicatamente la sospensione cellulare e raccogliendo tutte le cellule in una provetta conica da 15 mL.
nota: Evitare il pipettaggio aggressivo. Se le cellule non si staccano facilmente, incubare per altri 5 minuti.
- Aggiungere 1 volume di terreno EC ai 15 mL conici per inattivare l'Accutase, centrifugare a 200 x g per 5 minuti, rimuovere il terreno e sostituirlo con 1 mL di terreno EC (senza bFGF e RA).
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la densità cellulare a 14-20 x 106 cellule/mL.
nota: Le cellule sono ora pronte per essere seminate nel canale inferiore del chip per formare il "lato sangue".
3. Microfabbricazione del chip dell'organo
- Utilizzare un chip d'organo per il modello di chip BBB e la sua produzione come fatto in precedenza. Il chip dell'organo a canale alto (vedi Tabella dei materiali) è fabbricato da un elastomero di polidimetilsilossano (PDMS) altamente flessibile che contiene due canali su microscala sovrapposti e paralleli separati da una membrana porosa flessibile. Le dimensioni dei microcanali superiore e inferiore sono rispettivamente 1 mm x 1 mm e 1,0 mm x 0,2 mm. I due canali sono separati da una membrana porosa flessibile di 50 μm di spessore, realizzata in PDMS, contenente pori di 7 μm di diametro con spaziatura di 40 μm. La superficie della membrana porosa che separa i canali è di 0,171 cm2.
4. Preparazione delle patatine
- I chip per organi sono forniti preconfezionati all'interno del supporto del chip, eliminando la necessità di disturbare o distorcere l'allineamento del chip durante la manipolazione. Inoltre, il supporto del chip si collega in modo sicuro a un modulo portatile ("Pod") che funge da interfaccia tra il modulo di coltura e il chip.
- Spruzzare la confezione delle patatine con etanolo al 70% e portarle nella cabina di biosicurezza (BSC).
- Aprire la confezione e stendere il chip dell'organo in una capsula di Petri sterile. Maneggiare il portatrucioli solo lateralmente per evitare il contatto diretto con il truciolo.
- Assicurarsi che la linguetta del supporto sia rivolta a destra (Figura 1) e, quando si utilizzano più chip, allinearli tutti con lo stesso orientamento.
- Etichettare ogni chip sulla linguetta del supporto (la preparazione completa del chip e il flusso di lavoro sono mostrati nella Figura 2).
5. Attivazione superficiale e rivestimento ECM
- Preparazione della soluzione di attivazione superficiale
- Il reagente emulato 1 (ER-1), fornito in un flaconcino contenente 5 mg, è sensibile alla luce. Preparare la soluzione fresca di ER-1 immediatamente prima dell'uso. L'integrità dell'ER-1 è fondamentale per la corretta preparazione dei chip.
- Spegnere la luce nel BSC quando si maneggia ER-1.
nota: ER-1 è un irritante per gli occhi e deve essere maneggiato nel BSC con guanti adeguati e protezione per gli occhi.
- Lasciare che i reagenti ER-1 e ER-2 si equilibrino a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
- Proteggere la soluzione dalla luce avvolgendo una provetta conica sterile vuota da 15 ml con un foglio.
- Nel BSC, picchiettare brevemente la fiala ER-1 per depositare la polvere sul fondo.
- Aggiungere 1 mL di tampone ER-2 al flaconcino e trasferirne immediatamente il contenuto sul fondo della provetta conica da 15 mL avvolta. Non pipettare per mescolare. Il colore della soluzione trasferita al tubo conico sarà rosso.
- Ripetere il passaggio 5.1.6 3 volte. All'ultimo giro, tappare la fiala di ER-1 e capovolgere per raccogliere la polvere rimanente dal coperchio, quindi trasferire la soluzione nella provetta conica; questo porterà il volume totale a 4 mL di soluzione ER-1.
- Aggiungere 6 mL di soluzione ER-2 ai 4 mL di soluzione ER-1 nella provetta conica da 15 mL fino a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL. ER-1 deve essere completamente disciolto all'interno della soluzione di ER-2.
- Attivazione della superficie
- Utilizzando una pipetta P200 e un puntale per pipetta filtrato sterile da 200 μl, aspirare 200 μl di miscela ER-1.
- Posizionare la pipetta nell'ingresso inferiore e spingere 20 μl di miscela ER-1 attraverso il canale inferiore fino a quando la miscela inizia a fuoriuscire dall'uscita del canale inferiore.
- Aggiungere circa 50 μl di miscela ER-1 e posizionarla nell'ingresso del canale superiore. Spingere il composto attraverso il canale superiore fino a quando non inizia a fuoriuscire dall'uscita del canale superiore.
- Rimuovere tutta la miscela ER-1 in eccesso dalla superficie del truciolo mediante aspirazione delicata. Assicurarsi che la miscela ER-1 venga rimossa solo dalla superficie del truciolo e non dai canali.
- Verificare che i canali siano privi di bolle d'aria prima dell'attivazione dei raggi ultravioletti (UV). Se vengono rilevate bolle d'aria, rimuoverle lavando il canale con la miscela ER-1.
- Metti il piatto aperto contenente le patatine nella scatola della luce UV (fornita da Emulate Inc.).
- Impostare l'interruttore sul retro della scatola della luce UV sull'impostazione "Coerente". Accendere l'alimentazione e avviare l'attivazione UV. Lasciare le patatine sotto la luce UV per 20 min.
nota: Evitare l'esposizione del personale ai raggi UV.
- Rimuovere la miscela ER-1 da entrambi i canali.
- Lavare ogni canale con 200 μL di soluzione ER-2.
- Rimuovere ER-2 da entrambi i canali.
- Lavare ogni canale con 200 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) fredda sterile.
- Lasciare il DPBS freddo all'interno dei canali fino a procedere al passaggio successivo.
- Preparazione e rivestimento della matrice extracellulare (ECM)
- Preparare la soluzione ECM combinando i singoli componenti ECM con DPBS freddo, acqua o altro solvente fino alle concentrazioni di lavoro finali. La soluzione ECM deve essere preparata fresca ogni volta che viene utilizzata.
- Rivestire entrambi i canali superiore e inferiore del chip con ECM, con la composizione determinata dal tipo di cellula da seminare. La miscela ECM deve essere mantenuta con ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Utilizzare la laminina (50 μg/mL) per rivestire il "lato cervello" e il collagene IV e la fibronectina miscelati in un rapporto 4:1 (320:80 μg/mL) per rivestire il "lato sangue" come descritto nel paragrafo 5.6.
- Preparazione delle aliquote ECM
- Diluire 1 mg/mL di laminina in DPBS freddo a una concentrazione finale di 50 μg/mL. Aliquotare e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
- Sciogliere il collagene IV in acido acetico allo 0,1% a una concentrazione di 1 mg/mL. Incubare la soluzione a 2-8 °C per una notte o a RT per 1-3 ore o fino a completa dissoluzione.
- Preparare una miscela da 1 mL di collagene IV:fibronectina (320 μL di collagene IV, 80 μL di fibronectina, 600 μL di H2O sterile a doppia distillazione). La miscela può essere conservata a -20 °C.
- Rivestimento dei chip con ECM
- Aspirare completamente il DPBS freddo da entrambi i canali. Impostare una pipetta P200 in modo che assorba 100 μL di soluzione di collagene IV:fibronectina.
- Introdurre la soluzione attraverso l'ingresso del canale inferiore fino a formare una piccola goccia sull'uscita. Lasciare una piccola goccia sull'ingresso dopo aver rimosso il puntale della pipetta.
- Introdurre la soluzione di laminina attraverso l'ingresso del canale superiore fino a quando non si forma una piccola gocciolina sull'uscita. Lasciare una piccola goccia sull'ingresso dopo aver rimosso il puntale della pipetta.
- Osservare attentamente i canali per assicurarsi che non siano presenti bolle. Se sono presenti bolle, lavare il canale con la soluzione ECM appropriata fino a rimuovere tutte le bolle.
- Ripetere i passaggi 5.5.1–5.5.4 per ogni chip.
- Aggiungere 1,5 mL di DPBS al tappo di una provetta conica da 15 mL. Posizionare il tappo DPBS nella piastra di coltura da 150 mm con le patatine per fornire ulteriore umidità e sigillare la piastra con parafilm. Per ottenere i migliori risultati, incubare le patatine a 4 °C durante la notte.
nota: Se lo si desidera, le cellule possono essere seminate lo stesso giorno dell'attivazione del chip e del rivestimento ECM, anche se si preferisce l'incubazione notturna. I trucioli possono essere pronti per la semina 4 ore dopo aver aggiunto l'ECM e aver incubato i trucioli a 37 °C.
6. Semina del canale "lato cervello" e differenziazione delle sfere EZ in colture neurali miste
- Portare il piatto contenente le patatine preparate al BSC. Lavare delicatamente entrambi i canali con 200 μl di NDM.
- Evitando il contatto con le porte, aspirare con cura le goccioline di fluido in eccesso dalla superficie del chip. Agitare delicatamente la sospensione cellulare prima di seminare ogni chip per garantire una sospensione cellulare omogenea
- Seeding degli iNPC nel canale superiore per generare il "lato cervello"
- Seminare le cellule (1 x 106 cellule/mL) nel canale superiore del chip. Aggiungere un puntale P200 contenente 30-100 μl di sospensione cellulare all'ingresso del canale superiore e rilasciare delicatamente il puntale dalla pipetta. Prendere una pipetta P200 vuota, premere lo stantuffo, inserirla nell'uscita del canale superiore e tirare con cautela la sospensione a cella singola attraverso il chip.
- Coprire il piatto e trasferire al microscopio per verificare la densità di semina e la distribuzione omogenea delle cellule all'interno del canale superiore. Rimuovere delicatamente il puntale della pipetta dalle porte di ingresso e uscita del chip.
- La densità di semina dovrebbe apparire come una copertura del 20%. Se la densità di semina è superiore o inferiore al previsto o irregolare, rimettere i trucioli nella BSC, lavare il canale 2 volte con 200 μl di terreno fresco e ripetere il passaggio 6.3.1.
- Dopo aver confermato la corretta densità cellulare, posizionare immediatamente i trucioli nell'incubatore per 2 ore a 37 °C dopo aver seminato ogni lotto di trucioli. Lavare via le cellule che non si attaccano con NDM fresco.
- Mantenere le cellule in condizioni statiche a 37 °C con una sostituzione giornaliera di NDM per almeno 48 ore prima di iniziare il flusso. Le iBMEC possono essere seminate dopo che le iNPC si sono attaccate o il giorno successivo alla semina delle iNPC.
7. Semina di iBMEC nel canale inferiore per generare il "lato sangue"
- Portare il piatto contenente le patatine preparate al BSC. Lavare delicatamente il canale inferiore con 200 μl di terreno EC.
- Evitando il contatto con le porte, aspirare con cura le goccioline di EC in eccesso dalla superficie del chip, assicurandosi di lasciare il fluido in entrambi i canali. Agitare delicatamente la sospensione cellulare prima di seminare ogni chip per garantire una sospensione cellulare omogenea.
- Utilizzando una pipetta P200, aspirare 30-100 μl della sospensione cellulare iBMEC (14-20 x 106 cellule/mL) e posizionare il puntale nell'ingresso del canale inferiore. Scollegare delicatamente il puntale dalla pipetta, lasciando il puntale contenente le cellule nella porta di ingresso.
- Premere lo stantuffo di una pipetta P200 con il puntale vuoto, inserirlo nell'uscita del canale inferiore e tirare con cautela la sospensione a cellula singola attraverso il canale inferiore rilasciando lentamente lo stantuffo della pipetta.
- Aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla superficie del chip. Evitare il contatto diretto con le porte di ingresso e uscita per garantire che nessuna sospensione di celle venga aspirata fuori dai canali.
- Coprire il chip e trasferirlo al microscopio per osservare la densità di semina. Il canale inferiore deve essere riempito senza spazi osservabili tra le cellule quando osservato al microscopio a 4x o 10x (Figura 3).
- Se la densità di semina è inferiore al 90% di copertura o è distribuita in modo non uniforme, regolare la densità delle celle di conseguenza e ripetere i passaggi 7.2-7.6 fino a raggiungere la densità corretta all'interno del canale. Dopo aver confermato la corretta densità cellulare (Figura 3), seminare le cellule nei trucioli rimanenti. Per attaccare le cellule alla membrana porosa, che si trova nella parte superiore del canale inferiore, capovolgere ogni chip e riposare in una base per chip.
- Posizionare un piccolo serbatoio (tappo conico della provetta da 15 ml contenente DPBS sterile) all'interno della piastra da 150 mm per fornire umidità alle cellule. Incubare i chip a 37 °C per circa 3 ore, o fino a quando le cellule nel canale inferiore non si sono attaccate. Una volta che gli iBMEC si sono attaccati (~3 ore dopo la semina), capovolgere i chip in posizione verticale per consentire l'attacco delle celle alla parte inferiore del canale inferiore.
8. Avvio del flusso
- Il flusso viene in genere avviato 48 ore dopo la semina degli iBMEC. Questo tempo è necessario affinché gli iBMEC si attacchino saldamente al chip.
- Per mantenere il flusso laminare attraverso il chip, è importante degassare ed equilibrare la temperatura del fluido. Il fluido deve essere preriscaldato a bagnomaria a 37 °C per 1 ora.
- Fino a 50 mL di terreno riscaldato possono essere degassati mediante incubazione in un sistema di filtrazione sotto vuoto per 15 minuti.
- Adescamento di moduli portatili
- Igienizzare l'esterno dell'imballaggio del modulo portatile e dei vassoi con etanolo al 70%, pulire e trasferire al BSC. Aprire la confezione e posizionare i moduli nel vassoio. Orientali con i serbatoi verso il retro del vassoio.
- Pipettare 3 mL di terreno caldo e pre-bilanciato in ciascun serbatoio di ingresso. Aggiungere il terreno di coltura EC al serbatoio di ingresso del canale inferiore e NDM al serbatoio di ingresso del canale superiore (Figura 4).
- Pipettare 300 μl di fluido caldo pre-bilanciato in ciascun serbatoio di uscita, direttamente sopra ciascuna porta di uscita (Figura 4).
- Posiziona fino a sei moduli portatili su ciascun vassoio. Portare i vassoi all'incubatore e farli scorrere completamente nel modulo di coltura con la maniglia del vassoio rivolta verso l'esterno.
- Selezionare ed eseguire il ciclo "Prime" sul modulo di coltura. Chiudere lo sportello dell'incubatrice e lasciare che il modulo di coltura adeschi i moduli portatili (richiede ~1 min). Il ciclo di adescamento è completato quando sulla barra di stato viene visualizzato il messaggio "Pronto". Rimuovere il vassoio dal modulo di coltura e portarlo al BSC.
- Verificare che i moduli portatili siano stati adescati correttamente ispezionando la parte inferiore di ciascun modulo portatile nel BSC. Cerca la presenza di piccole goccioline su tutte e quattro le porte.
- Se un modulo portatile non mostra goccioline, eseguire nuovamente il ciclo di prima pagina su tali moduli. Se del materiale gocciolante sul vassoio (ciò può verificarsi più spesso dalle porte di uscita), pulire il vassoio con etanolo al 70%.
- Collegamento dei chip ai moduli portatili, regolazione e avvio del flusso
- Lavare delicatamente entrambi i canali di ciascun chip con un terreno di coltura specifico per cellule caldo ed equilibrato per rimuovere eventuali bolle nel canale e posizionare piccole goccioline di terreno (in base al terreno nel canale) sulla parte superiore di ciascuna porta di ingresso e uscita.
- Inserire i chip con i supporti nei moduli portatili e posizionarne fino a sei su ciascun vassoio. Inserire i vassoi nel modulo di coltura. Programmare le condizioni di coltura del chip d'organo appropriate (portata e allungamento) sul modulo di coltura.
- Le condizioni programmate inizieranno non appena il ciclo "Regolazione" sarà completato.
nota: Le portate per ciascun canale possono essere controllate in modo indipendente e possono essere impostate su velocità comprese tra 0 e 1.000 μl/h. Il chip BBB viene tipicamente coltivato a 30 μL/h. Quando si fanno scorrere fluidi come fluidi EC o ESM a 30 μL/h e 1000 μL/h, le forze di taglio sono rispettivamente di 0,01 dyn/cm2 e 0,33 dyn/cm2.
- Eseguire il ciclo di "Regolazione", che dura circa 2 ore, dopodiché il modulo di coltura inizierà a fluire alle condizioni di coltura del chip dell'organo preimpostate.
