Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione della Brain Slice
- Utilizzare topi maschi C57BL/6J, di 4-8 settimane. Alloggiare gli animali in una stanza climatizzata (21-23 °C; 50% di umidità; 12 ore/12 ore ciclo luce/buio, luci accese alle 8:00) con libero accesso a cibo e acqua.
- Prelevare un'aliquota di 250 ml di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) e metterla in un becher contenente ghiaccio. Allo stesso tempo, fornire gas continuo composto dal 95% di O2 e dal 5% di CO2.
- chirurgia
- Anestetizzare l'animale con isoflurano al 4% in una scatola di vetro per circa 3 minuti. Una volta che l'animale raggiunge una profondità chirurgica di anestesia (indicata dalla mancanza di una risposta al pizzicamento delle dita), posizionarlo su un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio tritato e rimuovere la testa usando le forbici.
- Esponi il cranio e taglia il muscolo rimanente. Quindi, usando i rongeur, staccare la superficie dorsale del cranio dal cervello. Taglia via i lati del cranio usando i rongeur. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con una soluzione di etanolo al 75%.
- Usando una spatola, taglia i bulbi olfattivi e le connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello e rimuovi il cervello. Dopo la decapitazione, trasferire rapidamente il cervello in un becher riempito con aCSF ossigenato ghiacciato.
- Preparazione del talamo mediale (MT)-corteccia cingolata anteriore (ACC) Brain Slice
nota: Preparare le sezioni che contengono il percorso dalla traduzione automatica all'ACC.
- Tagliare a mano il blocco cerebrale con due tagli sagittali di 2,0 mm lateralmente alla linea mediana in ciascun emisfero per visualizzare l'anatomia sottocorticale. Quindi eseguire due tagli angolati. Eseguire il primo taglio trasversale parallelo al tratto di fibra visibile nello striato.
- Effettuare il secondo taglio trasversale dalla connessione tra il cervelletto e la corteccia visiva al punto medio tra la commessura anteriore e il tratto ottico che sono ventrali e paralleli alla via del talamocingulato.
- Fissare il blocco cerebrale a una piastra angolare (~120°) con adesivo cianoacrilato e praticare un taglio appena sopra il punto di svolta del percorso. Aprire la piastra, appiattirla e incollarla sul tavolino da camera di un vibratomo.
- Realizzare fette di cervello mediale di talamo-ACC (500 μm di spessore) e poi immergerle in aCSF ossigenato ghiacciato. Trasferire le fette nella camera di registrazione e mantenerle a 32 °C in perfusione continua (12 ml/min) con aCSF ossigenato per 1 ora.
