Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Microdissezione del telencefalo dorsolaterale
- Preparare il terreno di dissezione (100 mL): 98,5 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), 0,5 mL 5 m, acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) pH 7,4, 1 mL di penicillina/streptomicina (10.000 unità/mL e 10.000 μg/mL).
- Filtrare-sterilizzare il mezzo di dissezione.
- Rimuovere gli embrioni embrionali del giorno 14 (E14) da un topo gravido C57/Bl6 (Mus musculus) in anestesia con isoflurano.
nota: Considera E0 come il giorno del rilevamento del tappo vaginale. La dissezione deve essere completata entro e non oltre 1 ora dalla rimozione dal topo gravido. Questo protocollo si applica anche agli embrioni E11-E17.
- Rimuovere gli embrioni mediante isterectomia in condizioni sterili.
- Trasferire gli embrioni in una piastra di Petri con un mezzo di dissezione freddo (4 °C).
- Rimuovere il cervello dal cranio tagliando lungo la fessura longitudinale. Il numero di embrioni di solito varia da cinque a dieci. Ogni cervello E14 produce circa 2 x 106 cellule, inclusi progenitori e neuroni postmitotici (rapporto 1:1)
nota: Utilizzare lo stereomicroscopio per i seguenti passaggi.
- Rimuovere le meningi utilizzando una pinza per dissezione. Dividi il telencefalo a metà per separare gli emisferi. Per isolare il telencefalo dorsolaterale, tagliare lungo la curva dorsomediale e il confine palliale-subpalliale utilizzando una pinza da dissezione. Trasferire il telencefalo dorsolaterale in una provetta da 2 ml con un mezzo di dissezione freddo (4 °C) fino a quando tutti i cervelli non sono stati sezionati.
2. Dissociazione e placcatura cellulare
- Preparare il terreno di proliferazione (50 ml di DMEM+10% FCS): 44 ml di terreno di coltura Dulbecco Modified Eagle's (DMEM), 5 ml di siero fetale di vitello (FCS), 0,5 ml di glucosio al 40%, 0,5 ml di penicillina/streptomicina (10.000 unità/ml e 10.000 μg/ml). Sterilizzare con filtro il mezzo di proliferazione.
- Preparare il terreno di differenziazione (50 mL di DMEM + 2% B27): 48 mL di DMEM, 1 mL di B27, 0,5 mL di glucosio al 40%, 0,5 mL di penicillina/streptomicina (10.000 unità/mL e 10.000 μg/mL). Filtrare-sterilizzare il mezzo di differenziazione.
- Dopo la microdissezione del telencefalo dorsolaterale da topi E14, centrifugare la provetta con il tessuto raccolto e il mezzo di dissezione a freddo (per 5 minuti a 4 °C, 340 x g) per far precipitare il tessuto.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta e aggiungere 1 mL di acido tripsin-etilendiamminetraacetico (EDTA) preriscaldato (37 °C) per la digestione chimica. Incubare per 15 minuti a 37 °C. Aggiungere 2 mL di terreno di proliferazione per arrestare l'attività della tripsina.
- Lucidare la punta di una pipetta Pasteur di vetro su un bruciatore a gas o un bruciatore Bunsen per alcuni secondi per restringere leggermente l'apertura. Lavare la pipetta aspirando FCS per rivestire il puntale. Per evitare bolle, dissociare meccanicamente le cellule con una pipetta Pasteur lucidata a fuoco e rivestita con FCS.
- Centrifugare le celle (per 5 minuti a 4 °C, 340 x g). Rimuovere il surnatante con una pipetta. Aggiungere 1 mL di terreno di proliferazione e risospendere le cellule utilizzando una pipetta. Ripetere questo passaggio una volta.
- Preparare una diluizione 1:1 della sospensione cellulare utilizzando una soluzione di Trypan Blue allo 0,4%. Le celle non vitali saranno blu. Utilizzando una camera Neubauer, contare il numero di cellule vitali (non colorate).
- Diluire le cellule in un mezzo di proliferazione per ottenere10-6 cellule/mL. Aggiungere 500 μl di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti (circa 2,5 × 105 cellule/cm2). Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2,
nota: Non utilizzare vetrini coprioggetti, poiché possono muoversi durante l'esperimento e modificare il campo di osservazione. In alternativa, utilizzare piastre di coltura tissutale con fondo in vetro.
nota: Se non si utilizzano multipiatti trattati con colture cellulari, è importante pretrattare le piastre con poli-D-lisina (50 μg/ml) per 2 ore a 37 °C. Le piastre trattate con PDL possono essere conservate a 4 °C dopo il lavaggio con acqua distillata.
