Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Raccogli DRG lombare da ratti sperimentali
- Utilizzare ratti Sprague-Dawley (SD) di 2 o 3 settimane per la raccolta di DRG lombari.
NOTA: I neuroni DRG raccolti da ratti di età superiore a 4 settimane non crescono bene nelle condizioni di coltura qui descritte.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave.
- Anestetizzare il ratto con una miscela 1:1 di tiletamina e zolazepam (20 mg/kg; iniezione intraperitoneale (IP)) e attendere che l'animale non mostri alcuna risposta di ritiro del piede in un test di pizzicamento delle dita.
nota: Diverse strategie di anestesia possono essere utilizzate con successo in questo protocollo.
- Sacrifica il topo per decapitazione con una ghigliottina commerciale.
- Usa la ghigliottina per isolare il tronco del ratto tra l'arto anteriore e il femore. Vedere la Figura 1A per un diagramma della regione da raccogliere.
nota: La linea di taglio caudale dovrebbe essere solo rostrale al femore. Il DRG L6 lombare verrà asportato se il sito di taglio è troppo alto nella colonna vertebrale.
- Tagliare lungo lo sterno e rimuovere tutti gli organi/tessuti con le forbici da dissezione (Figura 2A-a).
- Taglia lungo il lato del tronco per raccogliere la parte dorsale del ratto e rimuovere la pelle. Vedere la Figura 1B per una fotografia del tronco dorsale sezionato.
- Preparare il fazzoletto su ghiaccio prima di raccogliere DRG. Pulisci il pelo e il sangue dai guanti e sterilizzali con etanolo al 75% prima di procedere al passaggio successivo.
- Rimuovere i muscoli che coprono la colonna lombare. Per prima cosa, fai due tagli lungo i lati della colonna vertebrale (sinistra e destra) e un taglio laterale per segnare l'estensione rostrale della colonna lombare. Quindi, rimuovere i muscoli dorsali della colonna vertebrale con una pinza per tagliare l'osso (Figura 2A-b).
- Rimuovere la parte dorsale delle vertebre con una pinza per tagliare l'osso ed esporre il midollo spinale.
- Rimuovere il midollo spinale con le forbici da dissezione (Figura 2A-c) e le pinze (Figura 2A-d).
- Identificare il DRG lombare contando le vertebre dall'ultima costola (vertebra toracica 13). Vedere la Figura 1C per un diagramma delle posizioni delle vertebre.
- Raccogliere il DRG lombare bilaterale (L1-L6) con microforbici (Figura 2A-f) in una piastra di coltura da 35 mm con 2 ml di terreno ghiacciato privo di siero. Rimuovere le fibre neuronali (come indicato nella Figura 1C) dal DRG di collegamento, quindi trasferirle nel piatto di coltura per migliorare la purezza delle colture.
nota: Il DRG raccolto può essere mantenuto in media su ghiaccio per circa 1 ora. Nel frattempo, più ratti possono essere soppressi per creare un pool più ampio di DRG.
2. Cultura primaria del DRG del legname di ratto
NOTA: I seguenti passaggi dovrebbero essere eseguiti in una cappa a flusso laminare.
- Preparare un terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino, 100 mM di piruvato di sodio e 1x penicillina/streptomicina in 1x DMEM-F12.
- Rivestire la piastra a 24 pozzetti trattata con coltura cellulare con 200 μg/mL di poli-L-lisina per 2 ore, quindi lavare con acqua sterilizzata.
- Pre-incubare la piastra di coltura con 1 mL di terreno di coltura in un incubatore a 37 °C di CO2 prima dell'uso per almeno 30 minuti.
- Trasferire la piastra da 35 mm contenente DRG in una cappa laminare e lavare il DRG con un terreno privo di siero 3 volte con una pipetta.
nota: L'esterno della capsula deve essere pulito con etanolo al 75% prima di trasferirlo nella cappa. La parabola da 35 mm può contenere DRG da un certo numero di ratti (questo dipenderà dalle esigenze del progetto sperimentale).
- Spostare il DRG (da un singolo ratto o combinato da più ratti) in un nuovo piatto di coltura da 35 mm, che contiene 2 mL di collagenasi di tipo IA (1 mg/mL in terreno privo di siero) con pinzette sterili (Figura 2A-e).
nota: La soluzione di collagenasi deve essere sterilizzata facendola passare attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm.
- Digerire il DRG nella soluzione di collagenasi in un incubatore a 37 °C di CO2 per 30 minuti.
- Rimuovere la soluzione di collagenasi e lavare il DRG 3 volte in 2 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
nota: Potrebbero esserci fibre o tessuti residui che si staccano dal DRG nella soluzione. Rimuoverli con una pipetta con la soluzione di lavaggio.
- Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,05% nella piastra da 35 mm contenente DRG e digerire il DRG in un incubatore a 37 °C di CO2 per 30 minuti.
- Trasferire i 2 mL di soluzione contenente DRG in una provetta da centrifuga da 15 mL con una pipetta di vetro.
nota: Il DRG potrebbe attaccarsi alla pipetta di vetro, quindi questo passaggio deve essere eseguito con cura. La perdita di DRG può essere evitata mantenendo la soluzione contenente DRG nell'estremità conica di una pipetta di vetro (circa 0,5 mL) e trasferendo la soluzione nella provetta da centrifuga lentamente ma senza pause.
- Centrifugare la soluzione a 290 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere un altro 2 ml di terreno privo di siero per risospendere il DRG.
- Ripetere il passaggio 2.10 2 volte, ma l'ultima volta sostituire il terreno privo di siero con un terreno di coltura preriscaldato.
- Triturare manualmente il DRG circa 60 volte utilizzando una pipetta Pasteur lucidata a fiamma (lunghezza 230 mm e diametro interno della testa della punta 1 mm). Vedere la Figura 2B per una fotografia che confronta l'orifizio di una pipetta Pasteur lucidata a fiamma con una pipetta non lucidata.
nota: Il diametro interno della pipetta Pasteur lucidata a fiamma è circa il 10% più piccolo di quello della pipetta di controllo e l'interno dell'estremità conica dovrebbe essere più liscio. Fare attenzione a non creare bolle durante la triturazione delle cellule.
- Rimuovere la capsula rivestita di poli-L-lisina dall'incubatore di CO2. Aspirare il terreno di coltura incubato dalla piastra e seminare le cellule dissociate sulla piastra rivestita.
- Seminare le cellule DRG da un ratto (raccolta bilaterale da L1-L6, per 12 DRG totali) in quattro pozzetti di una piastra a 24 pozzetti; ci sono circa 5 x 104 cellule in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti><.
nota: Questa densità è adatta per l'immunocolorazione. Per il Western blot o l'estrazione dell'RNA, seminare le cellule DRG da un ratto (L1-L6 bilaterale) in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
- Sostituire il terreno di coltura il giorno successivo con l'aggiunta di 10 μM di citarabina (Ara-C) e 100 ng/mL di NGF e successivamente rinfrescare il terreno ogni due giorni.
nota: Anche i DRG toracici possono essere coltivati con questo protocollo, se sono stati raccolti dalla colonna vertebrale toracica.
