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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
NOTA: Le soluzioni per colture cellulari devono essere preparate utilizzando procedure sterili in una cappa di sicurezza biologica e filtrate a 0,2 μm per prevenire la contaminazione.
1. Preparazione delle soluzioni e terreno di coltura
- Preparare la soluzione di rivestimento di laminina diluendo 20 μL di 1 mg/mL di stock di laminina in 2 mL di H2O distillato sterile. Preparare il giorno della dissezione.
- Preparare una soluzione di arresto di siero (ES) equino (cavallo) al 10% aggiungendo 5 ml di ES a 45 ml di 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Filtro sterile con un sistema di filtraggio da 0,2 μm o un puntale con filtro a siringa. Conservare a 4 °C.
- Preparare una soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) al 4% aggiungendo 2 g di polvere di BSA a 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e portandola a un volume finale di 45 ml. Filtro sterile con un sistema di filtraggio da 0,2 μm o un puntale con filtro a siringa. Conservare a 4 °C.
- Preparare la soluzione madre di papaina diluendo la papaina a 3 mg/mL in 1x HBSS. Filtro sterile con un sistema di filtraggio da 0,2 μm o un puntale con filtro a siringa. Conservare a -20 °C.
- Preparare la soluzione di desossiribonucleasi (DNasi) aggiungendo 20 mg di polvere di DNasi all'H2O sterile e portandola a un volume finale di 20 mL. Filtro sterile con un sistema di filtraggio da 0,2 μm o un puntale con filtro a siringa. Conservare a -20 °C.
- Preparare una soluzione madre di acido ascorbico aggiungendo 352 mg di acido ascorbico all'H2O distillato sterile e portandolo a un volume finale di 20 mL. Se necessario, scaldare in un bagno a 37 °C per scioglierlo. Filtro sterile con un sistema di filtraggio da 0,2 μm o un puntale con filtro a siringa. Conservare a -20 °C.
- Preparare il terreno di coltura cellulare aggiungendo quanto segue a 50 ml di terreno neurobasale: 500 μl di glutamax (100x), 500 μl di siero equino, 1 ml di B-27, 100 μl di acido ascorbico, 500 μl di penicillina-streptomicina, 50 μl di kanamicina e 50 μl di ampicillina. Filtro sterile con sistema di filtraggio da 0,2 μm. Conservare a 4 °C.
- Preparare la soluzione di Triton X-100 allo 0,01% aggiungendo 1 mL di Triton X-100 a 9 mL di 1x PBS per ottenere una soluzione al 10%. Poiché Triton X-100 è viscoso, pipettare lentamente per consentire al puntale di riempirsi completamente. Scaldare in un bagno a 37 °C per sciogliere se necessario. Conservare a 4 °C.
- Per diluire il 10% di stock Triton X-100 allo 0,01%, eseguire 3 diluizioni seriali 1:10. Diluire 1 mL di brodo al 10% in 9 mL di 1x PBS per ottenere una soluzione all'1%. Diluire 1 mL di soluzione all'1% in 9 mL di 1x PBS per ottenere una soluzione allo 0,1%. Diluire 1 mL di soluzione allo 0,1% in 9 mL di 1x PBS per ottenere una soluzione allo 0,01%.
- Preparare soluzioni di siero di capra normale (NGS) al 10% e all'1% aggiungendo 1 mL di NGS a 9 mL di 1x PBS per una soluzione al 10% e 100 μL di NGS a 9,9 mL di 1x PBS per ottenere una soluzione all'1%.
- Preparare una soluzione madre di glutammato (100 mM) aggiungendo 735 mg di acido L(+)-glutammico all'H2O distillato sterile e portandolo a un volume finale di 50 mL. La solubilità a questa concentrazione sarà un problema. L'aggiunta di piccoli volumi (100 μL) di acido cloridrico 1 M è sufficiente per aumentare la solubilità.
- Preparare la soluzione madre di NBQX (10 mM) aggiungendo 50 mg di NBQX all'H2O distillato sterile e portandolo a un volume finale di 13 mL.
2. Preparazione di piatti di coltura e vetrini coprioggetti (Fatto il giorno prima della dissezione)
NOTA: Abbiamo scoperto che la combinazione di tre agenti di rivestimento, poli-L-lisina, poli-L-ornitina e laminina, consente un'adesione e una vitalità cellulare ideali.
- Collocare 10 piastre di Petri da 35 mm in una cabina di sicurezza biologica. Inserire due vetrini coprioggetti circolari da 12 mm in ogni piatto e riempire con il 70% di EtOH per 10 minuti. Utilizzare una linea a vuoto per aspirare l'EtOH rimanente da ogni piatto, consentendo all'EtOH di evaporare completamente.
- Pipettare ~90-100 μl di soluzione di poli-L-lisina allo 0,1% su ciascun vetrino coprioggetti, assicurandosi che l'intero vetrino coprioggetti sia coperto. Coprite le stoviglie con i coperchi e mettetele in un'incubatrice a 37 °C per 1 ora.
- Aspirare la restante soluzione di poli-L-lisina da ciascun vetrino coprioggetti e risciacquare con H2O sterile.
- Ripetere i passaggi 2.2 – 2.3 con una soluzione di poli-L-ornitina allo 0,1%.
- Ancora una volta, ripetere i passaggi 2.2 – 2.3 con una soluzione di laminina allo 0.01%. Collocare in un incubatore a 37 °C/5% di CO2 fino al momento della placcatura delle cellule il giorno successivo.
3. Dissezioni embrionali di topo
NOTA: Usiamo da 4 a 6 topi gravidi a tempo per coltura. Sebbene gran parte del processo di dissezione avvenga al di fuori di una cabina di sicurezza biologica, è comunque importante mantenere una procedura sterile. L'uso abbondante del 70% di EtOH sulle superfici vicino al microscopio di dissezione e sugli strumenti chirurgici è l'ideale. Durante la dissezione può essere indossata anche una maschera per prevenire ulteriormente la contaminazione. Inoltre, utilizziamo 4 antibiotici separati nel terreno di coltura, quindi la contaminazione è improbabile. Tuttavia, se l'uso di antibiotici è problematico, questa configurazione di dissezione potrebbe essere spostata all'interno di una cappa sterile. Per preservare la vitalità cellulare, tutte le soluzioni di dissezione devono essere pre-raffreddate a 4 °C e le dissezioni devono essere completate il più rapidamente possibile. Non eseguiamo le dissezioni su ghiaccio. Il metodo per la dissezione dei neuroni embrionali del mesencefalo di topo è identico ai metodi precedentemente descritti.
- Preparare uno spazio su un banco vicino a un microscopio da dissezione con un tampone assorbente e spruzzare abbondantemente con il 70% di EtOH.
- Spruzzare due piastre di Petri in vetro da 100 x 15 mm e una piastra di Petri in vetro da 50 x 10 mm con il 70% di EtOH e lasciare evaporare l'EtOH. Una volta evaporato, inserire 50 ml di 1x HBSS sterile in ciascuna piastra di Petri da 100 x 15 mm.
- Immergere le forbici chirurgiche, le pinze e la lama del microtomo in EtOH al 70% per almeno 10 minuti per sterilizzare. Posizionare gli strumenti sul tampone assorbente per farli asciugare.
- Utilizzando CO2 seguita da lussazione cervicale, sopprimere topi in gravidanza temporizzata di 2-3 mesi il giorno embrionale 14.
- Spruzzare l'addome dei topi soppressi con il 70% di EtOH. Usando una pinza, afferra l'addome inferiore e apri la cavità addominale usando le forbici chirurgiche. Inizia a tagliare vicino al punto in cui il forcipe tiene l'addome, praticando tagli laterali su ciascun lato fino a quando la parete addominale può essere ripiegata all'indietro e l'utero è chiaramente visibile.
- Usando le forbici chirurgiche, taglia entrambe le estremità del corno uterino. Quindi, rimuovi l'utero e mettilo in una capsula di Petri con 1x HBSS.
- Usando una pinza a punta dritta, rimuovi con cura gli embrioni dall'utero. Lascia gli embrioni in HBSS durante questo processo. Usando il forcipe o una lama per microtomo, decapita rapidamente gli embrioni tagliandoli vicino al collo. Effettuando un taglio il più livellato possibile.
- Al microscopio da dissezione, spostare la testa di un embrione in una capsula di Petri asciutta da 50 mm e posizionarla sul lato ventrale. Stabilizzare la testa con una pinza posizionandola e penetrandola vicino agli occhi/muso. La pinza deve essere inclinata verso il basso a ~45° per evitare di penetrare nel mesencefalo.
- Usando il forcipe, d'altra parte, rimuovi con cura lo strato traslucido di pelle e cranio appena prima della cresta prominente del mesencefalo. Inizia vicino alla linea mediana e rimuovi la pelle e il cranio caudalmente fino a quando il mesencefalo non è completamente esposto.
- Tenere la pinza perpendicolare al mesencefalo esposto, con una punta tra la corteccia e il mesencefalo e l'altra vicino al cervelletto. Premere e pizzicare le pinze insieme per rimuovere l'intero mesencefalo. Il segmento mesencefalico dovrebbe avere uno spessore di circa 0,5 mm. Posizionare il segmento mesencefalico nella seconda capsula di Petri riempita con 1x HBSS fresco. Ripeti questo processo per ogni embrione.
- Utilizzando il microscopio da dissezione, posizionare il segmento cerebrale con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Se le meningi sono ancora attaccate, rimuoverle con cura afferrandole con la pinza e sollevandole e allontanandole dal segmento cerebrale.
- Il segmento cerebrale dovrebbe avere 4 quadranti visibili. Posizionare il segmento in modo tale che i due quadranti più piccoli siano posizionati al di sopra dei due quadranti più grandi. C'è una cresta prominente che separa i due quadranti superiori (piccoli) dai due quadranti inferiori (grandi).
- Usando la pinza, pizzicare e separare i quadranti superiori da quelli inferiori, quindi scartare i quadranti superiori. I restanti quadranti inferiori avranno tessuto in eccesso lateralmente sul lato dorsale, questo tessuto apparirà meno opaco del restante tessuto ventrale. Rimuovere il tessuto dorsale meno denso e scartarlo. Il segmento rimanente dovrebbe contenere sia la Substantia nigra pars compacta (SNc) che l'area tegmentale ventrale (VTA).
- Usando la pinza, tagliare il segmento di tessuto ventrale rimanente in 4 pezzi più piccoli e, utilizzando una pipetta a foro largo da 1 ml, trasferire questi segmenti in una provetta conica da 15 ml con 1x HBSS. Mantenere il tubo conico con i segmenti cerebrali sul ghiaccio durante tutta la procedura.
- Ripeti questo processo per tutti i segmenti cerebrali rimanenti.
4. Dissociazione delle cellule
- Digestione enzimatica delle cellule
- Aspirare con cautela l'HBSS dalla provetta conica da 15 mL contenente i segmenti del mesencefalo, lasciando i segmenti sul fondo della provetta.
- Aggiungere ~800 μL di soluzione di papaina alla provetta e metterla in un'incubatrice a 37 °C per 7 minuti. Risospendere le cellule muovendo la provetta e sostituirle con l'incubatrice a 37 °C per altri 7 minuti.
- Con un puntale per pipetta da 1 mL a foro largo, rimuovere solo i segmenti del mesencefalo in un'aliquota da 1 mL di DNasi. Lasciare che i segmenti raggiungano il fondo dell'aliquota o circa 1 minuto di esposizione.
- Con un puntale per pipetta da 1 mL a foro largo, rimuovere solo i segmenti mesencefalici in una provetta conica da 15 mL contenente 2 mL di soluzione di arresto. Lasciare che i segmenti si depositino sul fondo del tubo e ripetere il risciacquo in un tubo conico aggiuntivo riempito con la soluzione di arresto.
- Triturazione meccanica della sospensione cellulare
- Nel secondo arresto, la provetta di risciacquo della soluzione, utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL a foro largo, pipettare le cellule su e giù 10 volte fino a quando non sono visibili segmenti di tessuto di grandi dimensioni. È importante evitare un'eccessiva titolazione per ridurre al minimo la lisi cellulare.
- Pipettare lentamente 300 μL di soluzione di BSA al 4% sul fondo della provetta conica da 15 mL contenente i segmenti cerebrali. Rimuovere con cautela il puntale della pipetta per mantenere uno strato di sospensione. Centrifugare a 0,4 x g per 3 min. Quindi, aspirare con cura il surnatante e risospendere le cellule in 400 μL di terreno di coltura cellulare.
5. Placcatura delle celle
NOTA: Sulla base dell'esperienza, vengono raccolte circa 100.000 cellule vitali per embrione. Topi gravidi di 2-3 mesi hanno tipicamente una cucciolata di 8-10 embrioni; quindi, una stima approssimativa per la resa totale di cellule per topo gravido a tempo è di circa 1 milione di cellule.
- Utilizzando un emocitometro, eseguire una conta cellulare e quindi diluire la sospensione a 2.000 cellule/μl utilizzando un terreno di coltura cellulare. Triturare brevemente per mescolare.
- Rimuovere i vetrini coprioggetti con la soluzione di laminina del passaggio 2 dall'incubatrice e aspirare la soluzione di laminina rimanente dai vetrini coprioggetti rivestiti utilizzando un aspirapolvere. Impiattare rapidamente per evitare che i vetrini coprioggetti si asciughino completamente. Pipettare 100 μl (2,0 x 105 cellule/vetrino coprioggetti) su ciascun vetrino coprioggetti e posizionare le piastre di Petri in un incubatore a 37 °C per 1 ora.
- Aggiungere con cautela 3 mL di terreno di coltura cellulare a ciascuna piastra e riporlo nell'incubatore a 37 °C. Eseguire cambi medio-medi due volte alla settimana per 2 settimane.
6. Infezione di colture cellulari a 14 DIV con vettori virali adeno-associati (AAV)
- Per ogni piatto, preparare 1 ml di terreno DMEM senza siero con 1 μL di hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 titolare)
- Aspirare il terreno di coltura cellulare da ciascuna piastra e sostituirlo con 1 mL di DMEM privo di siero contenente hSyn-GCaMP6f. Quindi, riposizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C per 1 ora.
- Aspirare il terreno privo di siero contenente AAV e sostituirlo con 3 mL di terreno di coltura cellulare. Rimettere le piastre nell'incubatore a 37 °C. Abbiamo scoperto che 5-7 giorni di infezione da AAV consentono livelli ideali di espressione di GCaMP. Durante questo periodo di infezione virale, continuare a cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni.
7. Imaging confocale in tempo reale di Ca2+ tra 19-21 DIV
- Preparazione dei buffer di registrazione
- Per preparare 1 L di tampone di registrazione HEPES, aggiungere: 9,009 g di NaCl, 0,3728 g di KCl, 0,901 g di D-glucosio, 2,381 g di HEPES, 2 mL di soluzione madre 1 M CaCl2 e 500 μL di soluzione madre 1 M MgCl2 a 800 mL di H2O distillato sterile. Portare il pH a 7,4 con NaOH. Portare ad un volume finale di 1 L.
- Per ottenere 200 mL di tampone di registrazione del glutammato 20 μM, diluire 40 μL di soluzione madre di glutammato 100 mM in 200 mL di tampone di registrazione HEPES descritto sopra.
- Per ottenere 200 mL di tampone di registrazione NBQX da 10 μM, diluire 200 μL di soluzione madre NBQX da 10 mM in 200 mL di tampone di registrazione HEPES.
- Imaging confocale
- Riempire una piastra di Petri sterile da 35 mm con 3 mL di tampone di registrazione.
- Estrarre dall'incubatrice a 37 °C una piastra di Petri da 35 mm con colture infette. Usando una pinza a punta fine, afferrare con cautela il bordo di un vetrino coprioggetti e trasferirlo rapidamente nella piastra di Petri riempita con il buffer di registrazione. Riposizionare il vetrino coprioggetti rimanente nel fluido nell'incubatore a 37 °C. Trasportare la capsula con il tampone di registrazione al microscopio confocale.
- Avviare il software di imaging. Procedi al passaggio successivo durante l'inizializzazione.
- Avviare la pompa peristaltica e posizionare la linea nel buffer di registrazione. Calibrare la velocità del flusso in modo che sia di 2 ml/min.
- Trasferire il vetrino coprioggetti infetto dalla piastra di Petri da 35 mm nel bagno di registrazione.
- Utilizzando l'obiettivo a immersione in acqua 10x e la luce BF, trova il piano di messa a fuoco e cerca una regione con un'alta densità di corpi cellulari neuronali. Passa all'obiettivo a immersione in acqua 40x e, utilizzando la luce BF, rifocalizza il campione.
- Nella finestra "Elenco coloranti" all'interno di FluoView, seleziona AlexaFluor 488 e applicalo.
- L'espressione di AAV può essere variabile; pertanto, al fine di prevenire la sovraesposizione e il fotosbiancamento dei fluorofori, iniziare con impostazioni di bassa HV e potenza laser. Per il canale AlexaFluor 488, impostare l'alta tensione (HV) su 500, il guadagno su 1x e l'offset su 0. Per la linea laser 488, impostare la potenza al 5%. Per aumentare il volume effettivo ripreso nel piano z, aumentare la dimensione del foro stenopeico a 300 μm. Utilizzare l'opzione di scansione "focus x2" per regolare in modo ottimale i segnali di emissione a livelli inferiori alla saturazione. Da qui, le impostazioni possono essere regolate fino a raggiungere la visibilità ideale di ciascun canale.
nota: Per catturare con precisione l'intera gamma di flussi di Ca2+ con GCaMP, regolare le impostazioni di base dell'HV e della potenza del laser in modo da consentire un aumento dell'intensità fluorescente senza saturare eccessivamente il rivelatore.
- Una volta ottimizzate le impostazioni del microscopio, spostare il tavolino per individuare una regione con più cellule che mostrano cambiamenti spontanei nella fluorescenza GCaMP6f e mettere a fuoco il piano desiderato per l'imaging.
- Utilizzare lo strumento "Ritaglia retto" per ritagliare il fotogramma dell'immagine a una dimensione che può raggiungere un intervallo di fotogrammi di poco meno di 1 secondo. Ciò è necessario per impostare l'intervallo di imaging a 1 fotogramma al secondo.
- Impostare la finestra "Intervallo" su un valore di 1,0 e la finestra "Num" su 600.
nota: Per fornire diversi buffer di registrazione al punto temporale desiderato (300 s), è importante calibrare la latenza della pompa per fornire la nuova soluzione al bagno. Ciò dipenderà dalla velocità di perfusione della soluzione (2 mL/min) e dalla lunghezza della linea utilizzata per pompare la soluzione.
- Per acquisire un filmato della serie t, selezionare l'opzione "Ora" e quindi utilizzare l'opzione di scansione "XYt" per avviare l'imaging.
- Osservare la barra di avanzamento dell'imaging e spostare la linea dal buffer di registrazione HEPES al tampone di registrazione del glutammato da 20 μM nel momento appropriato (ad esempio, se la latenza della pompa è calibrata per erogare la soluzione a 60 s, spostare la linea nel tampone glutammato a 240 fotogrammi per erogare glutammato a 300 s).
- Al termine dell'imaging, selezionare il pulsante Series Done e salvare il filmato della serie t finito. Continuare a perfondere 20 μM di glutammato per altri 5 minuti, in modo che i neuroni coltivati siano stati esposti al glutammato per un totale di 10 minuti. Ripetere questa procedura per ogni vetrino coprioggetti da riprodurre.
- Dopo l'ulteriore esposizione di 5 minuti al glutammato da 20 μM, rimuovere il vetrino coprioggetti dal bagno e rimetterlo nella piastra di Petri da 35 mm contenente il tampone di registrazione fino al completamento del giorno dell'imaging.