Preparazione di fette di corteccia rinale-ippocampo da un cervello di cucciolo di ratto

Abstract

Fonte: Valente, C. A., et al., Un modello di epilettogenesi in colture di fette organotipiche della corteccia rinale-ippocampo. J. Vis. (2021)

Il video dimostra un metodo per ottenere fette di corteccia rinale-ippocampo dal cervello di un cucciolo di ratto e coltivarle in inserti membranosi all'interno di una piastra multi-pozzetto riempita con terreno per ulteriori analisi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione delle fette di corteccia rinale-ippocampo

NOTA: La preparazione delle fette di corteccia rinale-ippocampo utilizza ratti P6-7 Sprague-Dawley.

1. Impostazione della coltura e preparazione del terreno
   1. Il giorno prima della coltura, preparare il terreno necessario e posizionarlo a 4 °C.
   2. Preparare il terreno di dissezione: 25 mM di glucosio nella soluzione salina bilanciata (GBSS) di Gey.
   3. Preparare il terreno di coltura: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% siero di cavallo (HS), 25 mM di glucosio, 30 μg/mL di gentamicina.
   4. Preparare il terreno di mantenimento: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM di L-glutammina, 30 μg/mL di gentamicina, HS (15%, 10%, 5% e 0%).
2. Raccolta di cervelli
   1. Poco prima di iniziare la coltura, aggiungere 1,1 mL di terreno di coltura a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti con una pipetta P1000 e posizionarla a 37 °C.
   2. Posizionare tutta l'attrezzatura (microscopio di dissezione, tritatessuti, lampada da dissezione, strumenti di dissezione, elettrodi, piastre, inserti e carta da filtro) all'interno della cabina di sicurezza biologica e sterilizzare sotto la luce UV per 15 minuti.
   3. Regolare lo spessore della fetta a 350 μm.
   4. Estrarre il GBSS dal frigorifero. Aggiungere 5 ml di GBSS a sei piastre di Petri. Saranno necessarie sei piastre di Petri per animale.
   5. Sopprimere il cucciolo di ratto. Esegui la decapitazione usando una forbice affilata alla base del tronco encefalico dell'animale.
   6. Lavare la testa dell'animale tre volte in GBSS freddo e portarla all'interno dell'armadio di sicurezza.
3. Isolamento tissutale e preparazione delle fette
   1. Inserire saldamente una pinza affilata nelle orbite dell'occhio per tenere la testa.
   2. Con una forbice sottile, tagliare la pelle/cuoio capelluto lungo la linea mediana partendo dal forame vertebrale verso i lobi frontali e metterla da parte.
   3. Tagliare allo stesso modo del cranio e lungo la fessura trasversale cerebrale (spazio tra il cervello e il cervelletto). Con una pinza lunga curva, allontanarla.
   4. Scartare i bulbi olfattivi con una spatola. Rimuovere il cervello dalla testa e posizionarlo in GBSS ghiacciato con la superficie dorsale rivolta verso l'alto (Figura 1A).
   5. Inserire la pinza sottile nel cervelletto e percorrere la linea mediana con la spatola aprendo ogni emisfero con molta attenzione (Figura 1B).
   6. Con una pinza a curva corta, rimuovere con cura il tessuto in eccesso che copre l'ippocampo, senza toccare la struttura dell'ippocampo. Quindi, con una spatola, tagliare sotto ogni ippocampo (Figura 1C).
   7. Prendi una semisfera e posizionala, con l'ippocampo rivolto verso l'alto, su una carta da filtro. Ripetere la procedura con l'altra semisfera e posizionarla parallelamente al primo, nella carta da filtro. Mettere la carta da filtro sul tritatutto, con gli emisferi perpendicolari alla lama, e tagliare gli emisferi in fette da 350 μm (Figura 1D).
   8. Mettere il fazzoletto affettato in una capsula di Petri con GBSS freddo (Figura 1E).
   9. Separare accuratamente le fette utilizzando gli elettrodi a punta tonda (Figura 1F). Conservare solo le fette con corteccia renale e ippocampo strutturalmente intatti. Le aree DG e CA dovrebbero essere perfettamente definite, così come la corteccia entorinale e peririnale (Figura 1G).
   10. Posizionare ogni fetta sull'inserto (Figura 1H-I), con una spatola e un elettrodo a punta tonda. Rimuovere il mezzo di dissezione in eccesso attorno a ciascuna fetta con una pipetta P20 (Figura 1J). Quattro fette di corteccia rinale-ippocampo possono essere coltivate in un unico inserto (Figura 1K).
4. Manutenzione della coltura
   1. Cambia il mezzo a giorni alterni.
   2. Riscaldare il fluido a 37 °C.
   3. Prendi i piatti dall'incubatrice. Prelevare ciascun inserto tenendo il bordo di plastica con una pinza (Figura 1L).
   4. Utilizzare una mano libera per aspirare il terreno dal pozzo. Riposizionare l'inserto nel pozzetto e aggiungere 1 mL, con una pipetta P1000, di terreno fresco riscaldato (Figura 1M). Ripetere l'operazione per tutti gli inserti. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate tra la membrana e il fluido.

Risultati

Figura 1: Procedura dettagliata per la preparazione di fette organotipiche della corteccia rinale-ippocampo. (A) Rimuovere il cervello dalla testa e metterlo in GBSS ghiacciato con la superficie dorsale rivolta verso l'alto. (B) Inserire la pinza nel cervelletto. Apri il cervello attraverso la linea mediana e rimuovi il tessuto in eccesso sopra l'ippocampo. (...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lame per manico bisturi	Strumenti per la scienza	Codice 10011-00
Sistema a camera a fette di cervello/tessuto	Strumenti Warner
Inserti per colture cellulari, 30 mm, PTFE idrofilo	Millipore SAS	PICM03050
Incubatrice convenzionale	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Linea funzione	Impostato a 37 °C e 5% di CO2
D(+)-Glucosio monoidrato	Merck Millipore	Codice 1.08342.1000
Soluzione di D-(+)-glucosio, 45% in acqua	sigma	G8769
di-Sodio idrogeno fosfato diidrato	Merck Milipore	Codice 1.06580.1000
Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox	Strumenti per la scienza	Codice 11254-20
Dumont #5 Pinze Standard Inox	Strumenti per la scienza	Codice 11251-20
Dumont #7 Pinze Standard Dumoxel	Strumenti per la scienza	Codice 11271-30
Dumont Medical #7S Pinza Curva Corta Inox	Strumenti per la scienza	Codice: 11273-22
Soluzione madre di gentamicina, 50 mg/mL	Thermo Fisher Scientifico	Codice 15750-037
salina bilanciata di Gey (GBSS)	Industrie Biologiche	01-919-1A
Elettrodi in vetro	Prodotti scientifici	GB150F-10	Punte rotonde fatte in casa
Pipette in vetro Pasteur, 230 mm	VWR Internazionale	612-1702
Siero di cavallo, inattivato a caldo (HS)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 26050-088
Spatola a iride curva	Strumenti per la scienza	Codice 10092-12
Cabina di sicurezza biologica di classe II Labculture	HERASafe	HS 12
Soluzione di L-Glutammina 200 mM (Q)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 25030-024
Neurobasale-A Medio (NBA)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 10888-022
Opti-MEM® I Siero Ridotto Medium	Thermo Fisher Scientifico	Codice 31985-047
Platino 5 lame	Gillette
Carta da filtro qualitativa, cellulosa, grado 1, 55 mm	Whatman	1001-055	Ritenzione media 11μm
Carta da filtro qualitativa, cellulosa, grado 1, 90 mm	Whatman	Codice 1001-090	Ritenzione media 11μm
Manico del bisturi	Strumenti per la scienza	91003-12
Piastre sterili a 6 pozzetti trattate con TC	Corning	CORN3516
Regolatore di temperatura	SISTEMI MEDICI CORP.	TC-102
Trinciafazzoletti	Il Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	Impostato su 350 μm