Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento, coltura e stimolazione delle cellule NK
- Generare un neurone nocicettore intatto (controllo del compagno di cucciolata; Topi TRPV1wt::D TAfl/wt) e ablati (TRPV1cre::D TAfl/wt) incrociando topi tossina lox-stop-lox-diphtheria (DTAfl/fl) con topi TRPV1cre/wt.
- Utilizzando l'inalazione di CO2, sopprimere un topo naive littermate control (TRPV1wt::D TAfl/wt).
- Raccogliere la milza in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml contenente 500 μl di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS).
- Omogeneizzare la milza con un pestello.
- Diluire le cellule con 1 mL di PBS sterile.
- Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 50 μm in una provetta conica da 15 mL.
- Rabboccare il volume (10 mL) con PBS sterile.
- Raccogliere 10 μl e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Centrifugare le cellule (500 × g, 5 min) e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule a una concentrazione di 10-8 cellule/mL in un terreno RPMI 1640 integrato.
- Seguire le istruzioni del produttore per purificare magneticamente le cellule Natural Killer (NK) della milza utilizzando un kit di isolamento delle cellule NK di topo. Confermare la purezza delle cellule NK utilizzando la citometria a flusso.
- Raccogliere 10 μl e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Centrifugare le cellule (500 × g, 5 min) e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule NK in un terreno di coltura RPMI 1640 integrato (contenente IL-2 e IL-15).
- Coltura 2 × 106 cellule NK/mL in una piastra con fondo a U a 96 pozzetti per 48 ore.
2. Isolamento e coltura dei neuroni DRG
- A 24 ore prima della fine della stimolazione delle cellule NK (fase 1.15), rivestire una piastra da 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di laminina (1 ng/mL) e incubare per 45 minuti (37 °C).
- Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione e lasciare asciugare i pozzetti all'aria in una cappa di biosicurezza.
- Utilizzando l'inalazione di CO2, l'eutanasia del neurone nocicettore intatto (controllo del compagno di cucciolata; TRPV1wt::D TAfl/wt) o ablato (TRPV1cre::D TAfl/wt) topi.
NOTA: L'inalazione di CO2 è preferita alla lussazione cervicale in quanto evita di interrompere i nervi spinali collegati al DRG (ganglio della radice dorsale).
- Fissare il mouse sulla tavola in posizione prona, sollevare la pelle e incidere la pelle lungo la colonna dorsale.
- Tagliare l'articolazione lombosacrale e separare l'osso sacro dalla colonna lombare con le forbici.
- Separare la colonna vertebrale tagliando i muscoli e le costole su entrambi i lati della colonna vertebrale in direzione cranica fino a raggiungere la base del cranio.
- Usando le forbici, taglia la colonna vertebrale all'altezza dell'articolazione atlanto-occipitale.
- Rimuovere i muscoli e il tessuto adiposo dalla colonna vertebrale.
- Appuntare e aprire la colonna vertebrale per rimuovere il midollo spinale e accedere al DRG. Cerca il DRG nei forami intervertebrali collegati al midollo spinale attraverso la radice dorsale ma separati dalle meningi.
- Raccogliere i DRG in una provetta conica da 15 mL riempita con 10 mL di DMEM integrato a freddo.
- Centrifugare il preparato (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 250 μL di PBS contenente Collagenasi IV (1 mg/mL) e Dispasi II (2,4 U/mL).
- Incubare il DRG con la soluzione di Collagenasi IV/Dispasi II (C/D) (80 min, 37 °C, leggera agitazione). Quando si raggruppano i gangli di diversi topi, mantenere un rapporto di 125 μl di soluzione C/D per ganglio.
- Per inattivare gli enzimi, aggiungere 5 ml di terreno DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) integrato.
- Centrifugare la soluzione (200 × g, 5 min) e rimuovere delicatamente il surnatante utilizzando una pipetta.
- Per evitare perdite cellulari indesiderate, lasciare ~100 μl di surnatante.
- Aggiungere 1 mL di terreno DMEM integrato.
- Utilizzando una pistola per pipette e tre pipette Pasteur in vetro di dimensioni decrescenti, triturare delicatamente (~10 su/giù per dimensione della pipetta Pasteur) il DRG in una preparazione a cellula singola.
- In una cabina di biosicurezza, diluire l'albumina sierica bovina (BSA) in PBS sterile (soluzione salina tamponata con fosfato) a una concentrazione finale del 15%. Conservare 1 mL di aliquote a -20 °C.
- Creare un gradiente BSA in una provetta conica da 15 mL aggiungendo 2 mL di PBS sterile ed erogando lentamente 1 mL di soluzione BSA al 15% sul fondo della provetta. Evitare di interrompere la sfumatura rimuovendo delicatamente la pipetta.
- Utilizzando una pipetta P200, pipettare lentamente la sospensione dei gangli triturati (che contiene i neuroni) sul lato della provetta nel gradiente.
- Centrifugare il gradiente BSA contenente neuroni (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Impostare l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga alla velocità minima.
NOTA: Dopo la centrifugazione, i neuroni saranno sul fondo della provetta, mentre i detriti cellulari saranno intrappolati nel gradiente BSA.
- Rimuovere delicatamente tutto il surnatante utilizzando una pipetta.
- Risospendere le cellule in 500 μL di Neurobasal.
- Piastra 104 neuroni per pozzetto (200 μL di neurobasale/pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti rivestita di laminina, a fondo piatto.
NOTA: In media, un investigatore sarà in grado di riempire ~8 pozzetti per topo.
- Coltivare i neuroni (37 °C, durante la notte) per consentire l'adesione.
3. Co-cultura
- Rimuovere lentamente il neurobasale dalla coltura neuronale.
- Dopo 48 ore di stimolazione con IL-2 e IL-15 (vedere i passaggi 1.14-1.15), risospendere le cellule NK e aggiungere 105 cellule NK/pozzetto alla coltura neuronale (piastra a fondo piatto a 96 pozzetti).
NOTA: In media, l'investigatore sarà in grado di riempire ~6 pozzetti per topo.
- Co-coltura delle cellule in MX neurobasale integrato (37 °C, 48 h).
