Isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici del mesencefalo embrionale primario di topo

Abstract

Fonte: Er, S., et al. Studio dell'accumulo di α-sinucleina indotto da fibrille preformate nei neuroni dopaminergici del mesencefalo embrionale primario. J. Vis. Exp. (2020).

Il video dimostra il processo di isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici dal mesencefalo di embrioni di topo. I pavimenti ventrali isolati del mesencefalo vengono dissociati utilizzando enzimi. I neuroni dopaminergici risultanti vengono raccolti e trasferiti in micro-isole all'interno di piastre multi-pozzetto. Le cellule vengono incubate con un mezzo neuronale dopaminergico per mantenere le cellule ad alta densità all'interno delle micro-isole.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparazione

1. Preparare il terreno neuronale dopaminergico (DPM) con 0,46% D-glucosio, 1% L-glutammina, 1% N2, 0,2% primocina, completando con la miscela modificata di terreno Eagle/nutrienti F-12 di Dulbecco (DMEM/F12). Filtrare il DPM dopo aver mescolato gli ingredienti. Conservare il DPM a 4 °C e scaldare ogni aliquota una sola volta.
   nota: Il DPM non deve contenere il fattore di crescita derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF), poiché riduce l'accumulo di α-sinucleina nei neuroni dopaminergici.
2. Preparare pipette di vetro siliconato che siano estremamente idrofobiche, riducendo così al minimo l'attaccamento alla superficie e la perdita di cellule durante la manipolazione iniziale dei neuroni embrionali.
   1. Aggiungere 10 ml di fluido siliconizzante a 1 litro di acqua distillata e mescolare mescolando in un recipiente da 2 litri. Lasciare le pipette di vetro immerse nella soluzione siliconante per 15 minuti.
   2. Sciacquare le pipette 3-5 volte con acqua distillata. Asciugare le pipette per una notte a temperatura ambiente (RT) o per 1-2 ore a 100-120 °C in uno spazio sterile riscaldato per accelerare l'essiccazione.
   3. Sterilizzare le pipette in autoclave standard in una sacca sigillata per autoclave.
3. Preparare piastre a 96 pozzetti rivestite di poli-L-ornitina (PO) con fondo trasparente aggiungendo 60 μL di soluzione di PO nei pozzetti centrali della piastra a 96 pozzetti da utilizzare per la semina dei neuroni, lasciando almeno una fila/colonna di pozzetti ai bordi della piastra per evitare effetti sui bordi. Conservare la lastra rivestita per una notte a 4 °C o 4 ore a RT.
4. Prima di galvanizzare le cellule, aspirare completamente il PO e lavare le cellule tre volte con 100 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x. Aspirare 1x PBS dai pozzetti e tenere aperto il coperchio della piastra per una completa asciugatura.
   nota: È possibile raccogliere gli ordini di acquisto usati e filtrarli per il riutilizzo. Questa operazione può essere ripetuta due volte per la stessa soluzione PO.
5. Aggiungere 50 μl di DPM ai pozzetti precedentemente rivestiti. Aspirare il DPM dai pozzetti con un puntale in plastica da 100 μL e contemporaneamente grattare il fondo del pozzetto con movimenti circolari per rimuovere il rivestimento sul perimetro di ciascun pozzetto. Un'isola rivestita in PO rimarrà al centro del pozzo.
6. Sotto una cappa laminare, aggiungere 10 μl di DPM al centro di ciascuna isola rivestita per creare micro isole.
   nota: Una piastra con micro isole ricoperte di DPM può essere conservata sotto la cappa a flusso laminare per 1-2 ore durante l'isolamento delle celle

2. Isolamento del pavimento mesencefalico ventrale da embrioni embrionali di topo del giorno 13.5 (E13.5)

1. Prima della dissezione, riempire una capsula di Petri di 10 cm con il tampone di Dulbecco e tenerla in ghiaccio.
2. Sopprimere una topolina incinta E13.5 secondo le linee guida dell'istituto. Posiziona il mouse sulla schiena e spruzza il corpo anteriore con etanolo al 70%. Sollevare la pelle sopra l'utero con una pinza e praticare un'incisione con le forbici chirurgiche per esporre l'utero.
3. Rimuovere con cautela l'utero e metterlo nella capsula di Petri precedentemente preparata con ghiaccio.
4. Utilizzando le forbici chirurgiche sotto il cappuccio laminare a RT, rimuovere con cura gli embrioni dall'utero. Rimuovere tutti i residui placentari dagli embrioni con una pinza e metterli in una nuova capsula di Petri da 10 cm riempita con tampone di Dulbecco.
5. Usando una pinza o un ago da dissezione, tagliare il quarto posteriore della testa dai punti contrassegnati da frecce nere nella Figura 1A. Togliete il pezzo tagliato dal resto dell'embrione (Figura 1B).
6. Posizionare la parte posteriore del pezzo tagliato verso l'osservatore (Figura 1C) e tagliarlo delicatamente dalla caudale al craniale (Figura 1D). Da 0,5 mm al di sotto dell'apertura cranica, tagliare una regione di 2 mm² –3 mm², mostrata nella Figura 1E.
7. Raccogliere il pavimento del mesencefalo ventrale (vedere Figura 1F) in una provetta da microcentrifuga vuota da 1,5 mL. Tenere la provetta della microcentrifuga sul ghiaccio fino a quando tutti i pavimenti del mesencefalo non sono raccolti al suo interno.
   nota: In alternativa, i pavimenti del mesencefalo possono essere raccolti con una micropipetta da 1 ml dopo la dissezione di tutti i cervelli embrionali.

3. Stabilire colture primarie di mesencefalo embrionale da embrioni di topo E13.5 in formato piastra a 96 pozzetti

1. Dopo la raccolta dei pavimenti del mesencefalo da tutti gli embrioni nella stessa provetta da 1,5 mL, rimuovere il tampone di Dulbecco residuo e lavare i pezzi di tessuto tre volte con 500 μL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) priva di Ca2⁺, Mg2⁺.
2. Rimuovere l'HBSS e aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,5% nella provetta. Incubare a 37 °C per 30 min.
3. Durante l'incubazione, riscaldare 1,5 ml di siero fetale bovino (FBS) a 37 °C, aggiungere 30 μl di DNasi I all'FBS e mescolare. Inoltre, lucidare a fuoco la punta di una pipetta di vetro siliconato. Assicurarsi che il foro non abbia spigoli vivi e abbia all'incirca le stesse dimensioni di un puntale per micropipetta da 1 mL.
   nota: In alternativa, per la triturazione è possibile utilizzare un puntale per micropipetta da 1 mL a bassa aderenza. Tuttavia, le pipette in vetro siliconato sembrano dare i migliori risultati.
4. Non appena termina l'incubazione nella fase 3.2, aggiungere 500 μl della miscela FBS/DNasi al tessuto parzialmente digerito. Utilizzare la pipetta di vetro per triturare il tessuto nella miscela FBS/tripsina. Triturare fino a quando i tessuti non si dissociano in minuscole particelle appena visibili. Evitare le bolle durante la triturazione.
5. Lasciare che le particelle rimanenti precipitino sul fondo della provetta per microcentrifuga per gravità. Senza pipettare il precipitato sul fondo, raccogliere il surnatante in una provetta conica vuota in polipropilene da 15 mL.
6. Diluire FBS/DNasi I dal passaggio 3.3 (98:2) con 1.000 μl di HBSS per ottenere FBS/DNasi-I/HBSS (49:1:50). Miscelare pipettando su e giù. Aggiungere 1.000 μl della nuova miscela alle particelle rimanenti nella provetta per microcentrifuga. Triturare nuovamente e ripetere il passaggio 3.5.
7. Ripetere ancora una volta il passaggio precedente per consumare tutti i FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Una volta raccolto tutto il surnatante all'interno della provetta da 15 mL (dai passaggi 3.5, 3.7 e 3.8), utilizzare una centrifuga da tavolo per centrifugare il surnatante (~3 mL) a 100 x g, per 5 min. Rimuovere il surnatante senza toccare le celle pellettate sul fondo.
9. Lavare il pellet di cellule aggiungendo 2 mL di DPM alla provetta e centrifugarlo a 100 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio 2 volte per ridurre al minimo i detriti nelle celle pellettate.
   nota: Utilizzare sempre DPM freschi e riscaldati per i neuroni in coltura. Per le fasi di lavaggio, il DPM non deve essere fresco, ma deve essere preriscaldato a 37 °C.
10. Diluire le cellule con DPM fresco e caldo e trasferirle in una provetta da microcentrifuga. La quantità di DPM per la diluizione dipende dal numero di embrioni utilizzati per la dissezione dei tessuti. Ad esempio, utilizzare 150 μL di DPM per diluire le cellule ottenute da dieci embrioni.
11. Trasferire 10 μL di cellule in DPM in una provetta per microcentrifuga. Mescolarli con 10 μL di colorante blu di tripano allo 0,4%. Contare le cellule vive (cioè il blu di tripano negativo) utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
    nota: Utilizzare 30.000 cellule per la placcatura per pozzetto per ottenere ~1.000 neuroni dopaminergici per pozzetto. Se la densità cellulare è superiore a ~30.000 cellule per 6 μl, diluire ulteriormente le cellule con DPM prima della piastratura in modo che il volume di semina non sia inferiore a 6 μl.
12. Senza toccare il fondo dei pozzetti, rimuovere il DPM dalle micro isole create al passaggio 1.6.
13. Per ottenere una densità cellulare riproducibile in ogni pozzetto, mescolare le cellule mediante pipettaggio delicato prima di essere piastrate nel pozzetto. Con una micropipetta da 1-10 μl, aggiungere 6 μl di cellule al centro del pozzetto, nella posizione di ciascuna micro isola precedente.
14. Riempire i pozzetti vuoti ai bordi della piastra con 150 μL di acqua o 1x PBS per ridurre al minimo l'evaporazione dai pozzetti contenenti colture neuronali. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO₂ per 1 ora.
15. Dopo 1 ora, rimuovere la piastra dall'incubatore, aggiungere 100 μL di DPM in ciascun pozzetto con le cellule e riporlo nell'incubatore.
16. Due giorni dopo la piastratura (giorno in vitro 2, o DIV2), rimuovere 25 μl e aggiungere 75 μl di DPM fresco per portare il volume finale del terreno a 150 μl ed evitare il più possibile l'evaporazione.
17. Sostituire metà del terreno con DPM fresco (ad esempio, rimuovere 75 μl e aggiungere 75 μl di DPM fresco) a DIV5. Non eseguire alcuna sostituzione del supporto dopo DIV5.

Risultati

Figura 1: Dissezione del pavimento mesencefalico da embrione di topo E13.5. (A) I punti di taglio sul quarto posteriore della testa sono contrassegnati da frecce nere e linee tratteggiate bianche. (B) Il pezzo è stato rimosso dal resto dell'embrione. Il pezzo rimosso viene cerchiato. (C) Il pezzo è stato ruotato di 90° per essere rivolto posteriormen...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,4% Trypan Macchia blu	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	15250061
Tubo in polipropilene CELLSTAR da 15 ml	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania	188261
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
5 M NaOH	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
ViewPlate a 96 pozzetti (nero)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	6005182
99,5% Etanolo (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlandia	N/A
Fluido siliconizzante AquaSil	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	Modellino TS-42799
Provetta per microcentrifuga autoclavata da 1,5 ml	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
Dispositivo di sonicazione Bioruptor	Diagenode, Liegi, Belgio	B01020001
Soluzione salina bilanciata di Hank priva di Ca2+, Mg2+ (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	Codice 14175-053
Pacchetti software CellProfiler e CellAnalyst	N/A	N/A	Software open source gratuito
Centrifuga 5702	Eppendorf AG, Amburgo, Germania	5702000019
Incubatore CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	N/A
Camera di conteggio	BioRad Inc., Hercules, California, Stati Uniti	1450015
Microscopio ad altissima risoluzione DeltaVision con tavolo d'aria e armadio	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, Stati Uniti	29254706
Deossiribonucleasi-I (Dnasi I)	Roche, Basilea, Svizzera	22098700
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	21331–020
Buffer di Dulbecco	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti	10500056
D-glucosio	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	G8769
Soluzione salina tampone fospoato (PBS)	N/A	N/A	Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki
Primocina	InvivoGen, San Diego, California, Stati Uniti	formica-pm-1, formica-pm-2
poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	P4957
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	11332481001
tripsina	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, Cina	Codice 2199700