Dissezione e montaggio di espianti cerebrali larvali di moscerini della frutta

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Sezionare e montare espianti di cervello larvale

1. Sezionare i cervelli larvali nella fisiologica soluzione salina esterna (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM Glucosio, 10 mM Saccarosio, 5 mM N-[Tris(idrossimetil)metil]-2-amminoetansolfonico (TES), 10 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES), 2 mM Ca²⁺, pH 7,2) sotto un microscopio da dissezione (potenza di ingrandimento 4,5x) con due paia di pinze da dissezione con punta standard #5 (11 cm). Usa un paio di pinze per tenere in posizione il corpo larvale e l'altro per sezionare attentamente il cervello. Preservare i dischi oculari, i lobi cerebrali e il midollo nervoso ventrale. Rimuovere i muscoli attaccati per ridurre al minimo i movimenti del campione durante l'imaging.
2. Preparare un vetrino (25 x 75 x 1,0 mm³) e utilizzare una siringa per disegnare una camera quadrata con grasso sottovuoto.
3. Aggiungere 20 μl di soluzione salina esterna alla camera quadrata con barriere ai grassi.
4. Trasferire i cervelli larvali sezionati nella camera sul vetrino utilizzando una pinza. Regolare la posizione del cervello sotto l'endoscopio di dissezione per assicurarsi che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto.
5. Coprire la camera con un vetrino coprioggetto (22 x 22 x 0,15 mm³). Il cervello larvale è ora montato sul vetrino all'interno di una camera riempita con la soluzione salina esterna (Figura 1B).
   nota: Premendo delicatamente sul vetrino coprioggetti si confina il cervello e si riduce la deriva del campione nella successiva sessione di imaging.

Figura 1: Flusso di lavoro del protocollo di imaging e quantificazione della dinamica dei dendriti. (A) Il protocollo contiene sei fasi che coprono la preparazione del campione, la raccolta delle immagini, l'elaborazione delle immagini e la quantificazione semi-automatica della dinamica dei dendriti. (B) Un diagramma schematico che illustra una camera di imaging contenente un espiante di cervello larvale montato con il lato dorsale rivolto verso l'alto. L'espiante cerebrale ha un neurone laterale ventrale (LNv) marcato individualmente in ciascun lobo ed è immerso nella soluzione salina esterna. Le barriere antigrasso sottovuoto sostengono il peso del vetrino coprioggetti e formano una piccola camera che impedisce al cervello di muoversi.