Differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte in cellule progenitrici neurali

Abstract

Fonte: Phillips, A. W., et al. Sviluppo di corpi embrioidi liberi da siero derivati da HiPSC per l'interrogazione di colture di cellule staminali 3D utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti. J. Vis. Exp. (2017).

Il video dimostra una tecnica per differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) in cellule progenitrici neurali (NPC). Inizialmente, le hiPSC vengono coltivate su uno strato di alimentazione di fibroblasti embrionali di topo (MEF). Successivamente, le cellule vengono staccate e trasferite su una piastra rivestita di biopolimero per consentire ai MEF di aderire e separarsi dalle hiPSC. Le hiPSC sospese vengono quindi trasferite su una piastra con fondo a V e centrifugate per formare aggregati. Infine, l'aggiunta di un mezzo di differenziazione induce la differenziazione delle hiPSC all'interno dell'aggregato in NPC.

Protocollo

1. Generazione di cellule progenitrici neurali

1. Mantenere le hiPSC derivate da fibroblasti e cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in piastre a 6 pozzetti su uno strato di cellule di alimentazione embrionale di topo (MEF) irradiato con γ in terreno iPSC umano integrato con piccole molecole.
   NOTA: La manutenzione giornaliera è una versione modificata delle procedure precedentemente riportate.
   1. Piastra 6 x 10⁵ MEF su ciascun pozzetto di una piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti in terreno consigliato da 300 μl/pozzetto (seguendo il protocollo del produttore).
   2. Dopo 48 ore, sostituire il terreno MEF con un terreno hiPSC da 300 μL/pozzetto per 1 ora prima di aggiungere hiPSC.
   3. Scongelare rapidamente le hiPSC in un bagno d'acqua a 37 °C e aggiungere lentamente 1 mL di terreno hiPSC goccia a goccia. Trasferire le hiPSC e il terreno in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere il terreno per portare il volume totale a 5 ml. Centrifugare per 4 minuti a 129 x g, aspirare il surnatante, risospendere delicatamente il pellet in 1 mL di terreno hiPSC con l'inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK) alla concentrazione 1:1.000.
   4. Placcare la sospensione cellulare (tipicamente seminata a 300.000 cellule/pozzetto) sullo strato cellulare MEF e incubare a 37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità.
   5. Monitorare attentamente la coltura di iPSC utilizzando un microscopio ottico. Dopo 48 ore, rimuovere le colture che hanno bordi irregolari, sono cresciute fino a diventare cistiche o appaiono bruno-giallastre al microscopio ottico per ridurre al minimo la differenziazione spontanea><. nota: Dopo 7-10 giorni, dovrebbero formarsi colonie di hiPSC. Le colonie dovrebbero essere rotonde, con bordi chiaramente definiti e densità cellulari uniformi, e prive di celle non uniformi poco impacchettate.
   6. Selezionare manualmente le colonie di hiPSC rotonde per eliminare la coltura dalle cellule differenziate spontaneamente. Espandi le colonie posizionandole su nuovi strati MEF. Espandi 1:3 ogni 7 giorni quando le colture si avvicinano alla confluenza e si congelano.
2. Dopo l'espansione e il congelamento delle celle (per il backup), far crescere le colonie di hiPSC su piastre fino a raggiungere il 50-75% di confluenza.
3. Sette giorni dopo la piastratura, utilizzare un trattamento enzimatico delicato (5-10 minuti con 300 μl di soluzione enzimatica) e una triturazione delicata (2-4 volte con una pipetta da 1.000 μl) per raccogliere e preparare le hiPSC per la differenziazione delle cellule precursori neurali.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 129 x g per 4 minuti, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno iPSC umano. Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura cellulare da 5 cm rivestita di gelatina allo 0,1% per 1 ora a 37 °C per eliminare i MEF e massimizzare la resa di hiPSC. Trasferire il terreno (con le celle non aderenti) in un altro piatto gelatinoso da 5 cm.
5. Trasferire le cellule non aderenti in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento. Sciacquare delicatamente le piastre con 3 ml di terreno e aggiungerlo alla provetta da 15 ml.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 129 x g per 4 minuti, aspirare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in terreno. Determinare il conteggio delle celle utilizzando un contatore di celle automatizzato. Piastra a 9.000 cellule/pozzetto in una piastra a fondo V a 96 pozzetti a bassa aderenza.
7. Centrifugare la piastra a 163 x g per 3 minuti. Incubare la piastra a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO₂. Utilizzando una pipetta, sostituire il 50% del terreno a giorni alterni rimuovendo metà del terreno e sostituendolo con un terreno di differenziazione fresco chimicamente definito 1 (DM1; Figura 1; Tabella dei materiali) per 14 giorni.

Risultati

Figura 1: Schema che illustra le prime fasi della preparazione degli SFEB. Dopo che le iPSC sono state raccolte utilizzando una dissociazione enzimatica, vengono piastrate in piastre a 96 pozzetti e centrifugate a 163 x g per 3 minuti per indurre una rapida aggregazione. Dopo 14 giorni, gli aggregati cellulari in vitro (DIV) possono essere trasferiti da piastre a 96 pozzetti tramite pipette a foro la...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
SFEB Terreni di coltura cellulare di differenziazione neuronale. Reagenti. Componenti
Terreno di induzione neurale STEMdiff (media hiPSC)	Tecnologie STEMCELL	0-5835	250 ml
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	Stelo globale	GSM-2001
Componenti multimediali DM1
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquido, 1:1	Invitrogen	10565018	385 ml
Sostituzione del siero knockout	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Penna/Streptococco	Invitrogen	15140122	5 ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5 ml
MEM Aminoacidi Non Essenziali Soluzione 10 mM (100X), liquido	Invitrogen	11140050	5 ml
2-Mercaptoetanolo (1.000X), liquido	Invitrogen	21985023	900ul
Piccole molecole
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10uM
Componenti/Materiali
Fibroblasti embrionali di topo	Stelo globale	GSC-6301G
Fondo a V a 96 pozzetti con coperchi	sempreverde	222-8031-01V
Reagente per dissociazione cellulare StemPro Accutase	ThermoFisher	A1110501
6 pozzetti fondo piatto	Falcone	353046