Differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte in cellule progenitrici neurali

1. Generazione di cellule progenitrici neurali

1. Mantenere le hiPSC derivate da fibroblasti e cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in piastre a 6 pozzetti su uno strato di cellule di alimentazione embrionale di topo (MEF) irradiato con γ in terreno iPSC umano integrato con piccole molecole.
   NOTA: La manutenzione giornaliera è una versione modificata delle procedure precedentemente riportate.
   1. Piastra 6 x 10⁵ MEF su ciascun pozzetto di una piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti in terreno consigliato da 300 μl/pozzetto (seguendo il protocollo del produttore).
   2. Dopo 48 ore, sostituire il terreno MEF con un terreno hiPSC da 300 μL/pozzetto per 1 ora prima di aggiungere hiPSC.
   3. Scongelare rapidamente le hiPSC in un bagno d'acqua a 37 °C e aggiungere lentamente 1 mL di terreno hiPSC goccia a goccia. Trasferire le hiPSC e il terreno in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere il terreno per portare il volume totale a 5 ml. Centrifugare per 4 minuti a 129 x g, aspirare il surnatante, risospendere delicatamente il pellet in 1 mL di terreno hiPSC con l'inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK) alla concentrazione 1:1.000.
   4. Placcare la sospensione cellulare (tipicamente seminata a 300.000 cellule/pozzetto) sullo strato cellulare MEF e incubare a 37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità.
   5. Monitorare attentamente la coltura di iPSC utilizzando un microscopio ottico. Dopo 48 ore, rimuovere le colture che hanno bordi irregolari, sono cresciute fino a diventare cistiche o appaiono bruno-giallastre al microscopio ottico per ridurre al minimo la differenziazione spontanea><. nota: Dopo 7-10 giorni, dovrebbero formarsi colonie di hiPSC. Le colonie dovrebbero essere rotonde, con bordi chiaramente definiti e densità cellulari uniformi, e prive di celle non uniformi poco impacchettate.
   6. Selezionare manualmente le colonie di hiPSC rotonde per eliminare la coltura dalle cellule differenziate spontaneamente. Espandi le colonie posizionandole su nuovi strati MEF. Espandi 1:3 ogni 7 giorni quando le colture si avvicinano alla confluenza e si congelano.
2. Dopo l'espansione e il congelamento delle celle (per il backup), far crescere le colonie di hiPSC su piastre fino a raggiungere il 50-75% di confluenza.
3. Sette giorni dopo la piastratura, utilizzare un trattamento enzimatico delicato (5-10 minuti con 300 μl di soluzione enzimatica) e una triturazione delicata (2-4 volte con una pipetta da 1.000 μl) per raccogliere e preparare le hiPSC per la differenziazione delle cellule precursori neurali.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 129 x g per 4 minuti, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno iPSC umano. Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura cellulare da 5 cm rivestita di gelatina allo 0,1% per 1 ora a 37 °C per eliminare i MEF e massimizzare la resa di hiPSC. Trasferire il terreno (con le celle non aderenti) in un altro piatto gelatinoso da 5 cm.
5. Trasferire le cellule non aderenti in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento. Sciacquare delicatamente le piastre con 3 ml di terreno e aggiungerlo alla provetta da 15 ml.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 129 x g per 4 minuti, aspirare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in terreno. Determinare il conteggio delle celle utilizzando un contatore di celle automatizzato. Piastra a 9.000 cellule/pozzetto in una piastra a fondo V a 96 pozzetti a bassa aderenza.
7. Centrifugare la piastra a 163 x g per 3 minuti. Incubare la piastra a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO₂. Utilizzando una pipetta, sostituire il 50% del terreno a giorni alterni rimuovendo metà del terreno e sostituendolo con un terreno di differenziazione fresco chimicamente definito 1 (DM1; Figura 1; Tabella dei materiali) per 14 giorni.

Figura 1: Schema che illustra le prime fasi della preparazione degli SFEB. Dopo che le iPSC sono state raccolte utilizzando una dissociazione enzimatica, vengono piastrate in piastre a 96 pozzetti e centrifugate a 163 x g per 3 minuti per indurre una rapida aggregazione. Dopo 14 giorni, gli aggregati cellulari in vitro (DIV) possono essere trasferiti da piastre a 96 pozzetti tramite pipette a foro largo su piastre a 6 pozzetti contenenti inserti per colture cellulari.