Sviluppo e mantenimento di corpi embrioidi privi di siero

Abstract

Fonte: Phillips, A. W., et al. Sviluppo di corpi embrioidi liberi da siero derivati da HiPSC per l'interrogazione di colture di cellule staminali 3D utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti. (2017).

Il video descrive la procedura per lo sviluppo di corpi embrioidi privi di siero (SFEB) da cellule progenitrici neuronali utilizzando vari mezzi di differenziazione privi di siero o DM. DM-2 facilita la maturazione e la disposizione dei neuroni per formare SFEB, mentre DM-3 viene utilizzato per un ulteriore mantenimento della crescita.

Protocollo

1. Induzione di corpi embrioidi senza siero (SFEB) (Figura 1)

1. Posizionare inserti per colture cellulari da 40 μm in piastre a 6 pozzetti e aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione 1 (DM1) (Tabella dei materiali) almeno 1 ora prima di aggiungere gli aggregati.
2. Trasferire gli aggregati di cellule progenitrici neurali con 20 μL di terreno utilizzando una punta della bocca larga 200 μL su inserti di coltura cellulare da 40 μm e cambiare il terreno in DM2 (Table of Materials).
   nota: Gli inserti per colture cellulari sono inserti specializzati che si trovano leggermente fuori dal fondo del pozzetto e sono costituiti da una membrana in politetrafluoroetilene sospesa su un telaio di plastica. Questa membrana è biocompatibile e può sostenere in modo efficiente il trasporto di nutrienti e ossigeno agli SFEB posti in cima. Sono comunemente usati con colture organotipiche di fette di ippocampo prelevate da un topo o da un ratto.
   1. Trasferire 4-6 aggregati in un inserto di coltura cellulare e lasciare uno spazio adeguato tra gli aggregati. Rimuovere quanta più soluzione in eccesso possibile utilizzando un puntale per pipetta fine (ad es. puntale da 200 μl).
      NOTA: È accettabile disturbare brevemente l'SFEB poiché si sposteranno sull'inserto di coltura cellulare mentre la soluzione viene rimossa intorno agli SFEB.
   2. Mantenere le colture in 1 mL di DM2 a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2. Utilizzando una pipetta, sostituire il 75% del terreno a giorni alterni rimuovendo tre quarti del terreno e sostituendolo con tre quarti di terreno fresco. Ad esempio, rimuovere 750 μl di terreno e aggiungere 750 μl di terreno fresco.
3. Dopo 14 giorni di coltura, passare al terreno DM3 (Table of Materials) con un cambio del terreno del 75% a giorni alterni e per altri 16 giorni.
4. Per mantenere gli SFEB sugli inserti di coltura cellulare oltre i 30 giorni, cambiare il terreno a giorni alterni per 60, 90 e 120 giorni.
   nota: Gli SFEB cresceranno fino a circa 1.000 μm di diametro e hanno tipicamente uno spessore di 100-150 μm.
5. Staccare gli SFEB dall'inserto pipettando delicatamente il terreno utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga da 200 μl. Per trasferire gli SFEB, utilizzare un puntale per pipetta a bocca larga per aspirare delicatamente i corpi nel puntale della pipetta. Dopo aver caricato SFEB nel puntale della pipetta, trasferire delicatamente in piastre a 12 pozzetti e lavare con 300 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per pozzetto.

Risultati

Figura 1: Cronologia dei cambiamenti e delle fasi medie durante la crescita e l'espansione di SFEB.

Dopo che gli SFEB sono stati trasferiti agli inserti, subiscono due cambiamenti del terreno a 14 e 28 giorni in vitro (DIV). Vengono tipicamente raccolti per esperimenti a DIV 30, 60 e 90. Gli inserti superiori mostrano diverse fasi in questo processo. B...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
SFEB Terreni di coltura cellulare di differenziazione neuronale. Reagenti. Componenti
Terreno di induzione neurale STEMdiff (media hiPSC)	Tecnologie STEMCELL	0-5835	250 ml
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	Stelo globale	GSM-2001
Componenti multimediali DM1
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquido, 1:1	Invitrogen	10565018	385 ml
Sostituzione del siero knockout	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Penna/Streptococco	Invitrogen	15140122	5 ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5 ml
MEM Aminoacidi Non Essenziali Soluzione 10 mM (100X), liquido	Invitrogen	11140050	5 ml
2-Mercaptoetanolo (1.000X), liquido	Invitrogen	21985023	900ul
Componenti multimediali DM2
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquido, 1:1	Invitrogen	10565018	500ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5 ml
Penna/Streptococco	Invitrogen	15140122	5 ml
Integratore N-2 (100X), liquido	Invitrogen	17502048	10 ml
Componenti multimediali DM3
NEUROBASAL Medium (1X), liquido	Invitrogen	21103049	500ml
Integratore di B-27 Meno Vitamina A (50X), liquido	Invitrogen	12587010	10 ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5 ml
Penna/Streptococco	Invitrogen	15140122	5 ml
Componenti/Materiali
	Millicella	PICM0RG50
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 ml