Costruzione di circuiti neuronali modellati su un array multi-elettrodo

Abstract

Fonte: Kanner, S., et al. Progettazione, trattamento superficiale, placcatura cellulare e coltura di reti neuronali modulari composte da circuiti funzionalmente interconnessi. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra il processo di coltura di cellule neuronali su un array multi-elettrodo (MEA) modellato per stabilire reti neuronali modulari. Questo metodo consente lo studio della trasmissione del segnale neurale e delle interazioni cellulari.

Protocollo

1. Preparazione dell'array multi-elettrodo (MEA)

1. Pulire MEA in questo ordine (Tabella dei materiali):
   1. Lavare con acqua sotto l'acqua corrente e sonicare in un detergente enzimatico concentrato 3 volte.
   2. Sonicare in acqua distillata 3 volte.
   3. Lavare con acqua distillata (nella cappa, punta da 1.000 μl) per 3 volte e porre sotto l'ultravioletto (UV) per 30 minuti.
2. Supporto alla preparazione della rete:
   1. Preparare lo stampo della rete di supporto progettato.
      1. Versare il polidimetilsilossano (PDMS) in una piastra a 12 pozzetti (22 mm di diametro).
      2. Quando il PDMS è indurito, rimuovere lo stampo e, utilizzando un bisturi, praticare un foro al centro per creare una forma ad anello.
      3. Posizionare uno stampo per rete di supporto progettato al centro del MEA (Figura 1A) e coprire il resto della superficie con poli-D-lisina (PDL) per 2 ore a temperatura ambiente (RT).
   2. Rimuovere il PDL utilizzando una pipetta e lavare con acqua distillata.
   3. Togliete lo stampo e lasciate asciugare (Figura 1A).
3. Allineare lo stencil a MEA nel modo seguente:
   1. Posiziona lo stencil sul micromanipolatore designato. Utilizzare un microscopio invertito per allineare con precisione la struttura modellata agli elettrodi e abbassare lo stencil fino a posizionarlo sulla superficie MEA (Figura 1B).
      nota: Il contatto con un MEA ben pulito fornisce un'adesione competitiva tra il PDMS e il MEA stesso.
   2. Sollevare il micromanipolatore e, se necessario, utilizzare una pinzetta per applicare una piccola quantità di pressione sopra il PDMS per evitare che si stacchi dal MEA.
   3. Premere delicatamente lo stencil sulla superficie MEA e utilizzare un microscopio per verificare che sia saldamente fissato e ben allineato (Figura 1C-D).
4. Mettere MEA in una camera a vuoto per 15 minuti; mettere una goccia da 1 ml di PDL sullo stencil.
5. Inserire nella camera a vuoto 2 volte per 20 minuti ciascuna. Lasciare asciugare il PDL O/N nell'incubatrice.
6. Prima di placcare, rimuovere gli stencil PDMS dai MEA e lavarli con acqua sterile. Porre sotto l'illuminazione UV per 7 min.

2. Placcatura

1. Calcola il numero di cellule necessarie per la placcatura utilizzando un emocitometro
   1. Assicurarsi che la camera di conteggio (emocitometro) sia pulita e posizionare un vetrino coprioggetti (utilizzare alcol per pulire).
   2. Diluire 10 μl della sospensione cellulare in 190 μl di terreno di placcatura (diluizione 1:20).
   3. Caricare 10 μl di cellule diluite sul bordo della camera di conteggio e pipettare lentamente le cellule, lasciando che la camera si riempia da sola.
   4. Utilizzando un microscopio invertito, visualizzare la griglia dell'emocitometro. Determinare il numero di cellule nella camera mediante conteggio diretto (le cellule sane dovrebbero essere rotonde). Conta le celle all'interno del quadrato grande senza che quelle attraversino i bordi.
   5. Calcola la concentrazione di cellule:
      Numero totale di cellule/1000 μl = Totale delle cellule contate × fattore di diluizione × 10⁴ (area dell'emocitometro).
      nota: Ad esempio, se il fattore di diluizione era 20 e il totale delle cellule contate era 100:
      100 × 20 × 10⁴ = 0,1 x 10⁷ celle/1.000 μl o 1 x 10⁶/100 μl. Per placcare 0,75 x 10⁶ celle, prelevare 75 μl dalle celle.
2. Prendere il numero di cellule necessarie per la placcatura per singola MEA o piastra di Petri, risospendere le cellule per prevenire l'aggregazione e piastrle al centro, sopra l'area modellata (le cellule possono essere diluite nel terreno se necessario). Per il MEA, posizionare una goccia di 100 μl al centro. Per il vetrino coprioggetti, posizionare una goccia da 1.000 μl al centro.
3. Incubare le cellule piastrate a 37 °C per 40 minuti. Aggiungere il terreno di placcatura alle cellule piastre, fino a 1 ml per MEA e 2 ml per vetrino coprioggetti.
4. Conservare a 37 °C e diluire con terreno di coltura fresco arricchito con 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 e 0,75% di glutamax ogni 4 giorni.
5. A partire dal 6/7 DIV, dopo aver visto le connessioni tra le isole, diluire il terreno con 10 μl/ml di FUDR (25 mg di deossiuridina + 62,5 mg di uridina in 12,5 ml di MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) o qualsiasi altro agente anti-mitotico per prevenire la proliferazione gliale.

Risultati

Figura 1. Deposizione di strutture PDMS su un MEA. (A) Stampo PDMS a forma di anello (contrassegnato dalla freccia rossa) montato su un MEA. Lo stampo viene utilizzato per rivestire l'area destinata alla rete neuronale di supporto e situata alla periferia dell'area di coltura (questa è limitata dall'anello montato sul MEA e contrassegnato dalla freccia verde). (B) Allineamento di ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PDMS, Sylgard 184	Dow Corning
Camera a vuoto Nalgene	termo	Codice: 5305-0609
Poli-D-lisina PDL	sigma	P7886
Piastra di coltura a 12 pozzetti	sigma	CLS3336
5-Fluoro-2'-deossiuridina	sigma	F0503
MEA1060-Inv-BC	Sistemi multicanale
TC02	Sistemi multicanale
Penna Streptococco	Industrie Biologiche Beit Haemek	03-033-1c
B-27	Gibco	17504044
glutaMAX	Gibco	Codice 35050-038
MEM Minimo Essenziale Medio-Aquila	Industrie Biologiche Beit Haemek	01-025-1B
Micro array di elettrodi 4Q	Sistemi multicanale	60-4QMEA1000iR-Ti-pr	Manuale di pulizia: http://www.multichannelsystems.com