Differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane ingegnerizzate in motoneuroni funzionali

Abstract

Fonte: Garone, M. G., et al. Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in motoneuroni funzionali spinali e cranici utilizzando vettori PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra il processo di differenziazione delle iPSC umane in motoneuroni. Il razionale prevede l'utilizzo di iPSC che sono state geneticamente modificate per esprimere specifici fattori di trascrizione. Quando viene coltivato in un terreno contenente doxiciclina, questo antibiotico innesca l'espressione di fattori di trascrizione, promuovendo così la differenziazione delle iPSC nei progenitori dei motoneuroni. In definitiva, i progenitori vengono coltivati in un mezzo neuronale per produrre motoneuroni maturi e funzionali.

Protocol

1. Manutenzione delle iPSC umane

1. Preparazione di lastre rivestite a matrice
   1. Scongelare un flaconcino da 5 mL di matrice (vedere Tabella dei materiali) a 4 °C per una notte. Le matrici originali sono disponibili in diverse concentrazioni e le aliquote sono realizzate in base al fattore di diluizione indicato nella scheda tecnica e sono specifiche per il singolo lotto. È fondamentale mantenere la fiala e i tubi freddi per evitare la gelificazione prematura della matrice. Erogare la matrice in aliquote in criotubi pre-raffreddati su ghiaccio. Congelare le aliquote non utilizzate a -20 °C.
   2. Mettere un'aliquota sul ghiaccio per circa 2 ore per scongelare.
   3. Diluire l'aliquota della matrice con 20 mL di DMEM/F12 freddo in una provetta conica da 50 mL.
   4. Mescolare bene ed erogare 1 mL di matrice diluita in piastre da 35 mm (quantità equivalenti per superficie di altre piastre).
   5. Conservare le stoviglie contenenti matrice diluita per 1 ora a temperatura ambiente per consentire la copertura.
      nota: Le stoviglie, sigillate con parafilm, possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Preparazione della soluzione madre (20 mL) e 1x aliquote di lavoro del reagente delicato per la dissociazione cellulare (vedi Tabella dei materiali).
   1. Sciogliere la polvere a 10 mg/mL in PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libero)
   2. Sterilizzazione del filtro attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm.
   3. Preparare 20 aliquote (1 mL ciascuna) e conservarle a -20 °C.
   4. Prima dell'uso, diluire un'aliquota in PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libero) a 1 mg/mL (1x aliquote di lavoro).
      NOTA: 1x aliquote di lavoro può essere conservato a 4 °C per 2 settimane.
3. Passaggio di iPSC umane.
   1. Prima di iniziare: Se conservate a 4 °C, preriscaldare le piastre rivestite di matrice nell'incubatore a 37 °C per 20-30 minuti. Preriscaldare a temperatura ambiente la quantità di terreno iPSC umano (vedi Tabella dei materiali) necessaria. Preriscaldare il DMEM/F12.
   2. Aspirare il terreno di coltura.
   3. Sciacquare le iPSC con PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libero).
   4. Aggiungere 1 soluzione di dissociazione delicata (0,5 mL per una piastra da 35 mm). Incubare a 37 °C fino a quando i bordi delle colonie iniziano a staccarsi dalla piastra, di solito 3-5 minuti.
   5. Aspirare la soluzione di dissociazione delicata, facendo attenzione a non staccare le colonie di iPSC.
   6. Lavare le cellule con DMEM/F12 (2 mL per una piastra da 35 mm) e aspirare, facendo attenzione a non staccare le cellule. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
   7. Aggiungere il terreno iPSC umano (1 ml per una piastra da 35 mm).
   8. Staccare delicatamente le colonie con un sollevatore di cellule e trasferirle in una provetta da 15 mL.
   9. Rompere delicatamente i grumi cellulari pipettando su e giù con un pipettatore P1000 3-4 volte.
   10. Aspirare il surnatante dalla/e piastra/e rivestita/e di matrice.
   11. Seminare le cellule nel volume di coltura appropriato del terreno iPSC umano. Il rapporto di divisione può variare da linea a linea ed è di circa 1:4-1:8. Cambia il mezzo ogni giorno.

2. Generazione di linee iPSC inducibili NIL e NIP

1. Trasfezione cellulare
   1. Sciacquare le cellule con PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libero).
   2. Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare (vedere la Tabella dei materiali) (0,35 mL per una piastra da 35 mm) e incubare a 37 °C fino a separare le singole cellule (5-10 min).
   3. Completare delicatamente la separazione cellulare pipettando su e giù con un pipettatore P1000 3-4 volte.
   4. Raccogliere in una provetta da 15 mL e aggiungere PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free) a 10 mL. Conta le celle.
   5. Pellettare 10⁶ celle e risospendere in 100 μl di Buffer R (incluso nel kit di elettroporazione delle celle; vedi Tabella dei materiali).
   6. Aggiungere DNA plasmidico per la trasfezione: 4,5 μg di vettore trasponibile (epB-Bsd-TT-NIL o epB-Bsd-TT-NIP12) e 0,5 μg di plasmide trasposasi piggyBac.
   7. Trasfettare con il sistema di elettroporazione della cella (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore e come precedentemente descritto con i seguenti parametri: tensione 1.200 V, larghezza 30 ms, 1 impulso. Seminare le cellule in un terreno iPSC umano integrato con 10 μM di Y-27632 (inibitore ROCK, vedi Tabella dei materiali) in un piatto rivestito di matrice di 6 mm.
2. Selezione con antibiotici
   1. Due giorni dopo la trasfezione, aggiungere 5 μg/mL di blasticidina al terreno di coltura.
   2. La maggior parte delle cellule non trasfettate morirà entro 48 ore dalla selezione della blasticidina. Mantenere le cellule in blasticidina per almeno 7-10 giorni per controselezionare le cellule che non hanno integrato i transgeni nel genoma.
   3. Mantenere cellule stabilmente trasfettate come una popolazione mista, composta da cellule con un numero diverso di transgeni e diversi siti di integrazione, o isolare singoli cloni.
   4. Preparare un piatto aggiuntivo per verificare l'efficace espressione dei transgeni dopo l'induzione di 1 μg/mL di doxiciclina mediante RT-PCR con primer specifici per i transgeni per Ngn2 (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Rovescio: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT).
   5. In questa fase, congelare le scorte delle nuove linee NIL- e NIP-iPSC in un mezzo di congelamento per iPSC umane (vedi Tabella dei materiali).

3. Differenziazione dei motoneuroni

1. Dissociare le cellule con il reagente di dissociazione cellulare come descritto (passaggi 2.1.1.-2.1.3.). Raccogliere le cellule dissociate in una provetta da 15 mL e diluirle con 5 volumi di DMEM/F12. Pellettare le cellule e risospendere in un terreno iPSC umano integrato con un inibitore ROCK da 10 μM. Contare le cellule e i semi su piastre rivestite di matrice a una densità di 62.500 cellule/cm².
2. Il giorno seguente, sostituire il terreno con DMEM/F12, integrato con 1 analogo stabile della L-glutammina, 1 integratore di colture cellulari di aminoacidi non essenziali (NEAA) e 0,5 volte penicillina/streptomicina, contenente 1 μg/mL di doxiciclina. Questo è considerato come il giorno 0 di differenziazione. Il giorno 1, rinfrescare il terreno e la doxiciclina.
3. Il giorno 2, cambiare il terreno con Neurobasal/B27 (terreno neurobasale integrato con 1x B27, 1x analogo stabile della L-glutammina, 1x NEAA e 0,5x penicillina/streptomicina), contenente 5 μM di DAPT, 4 μM di SU5402 e 1 μg/mL di doxiciclina (vedere la Tabella dei materiali). Rinfrescare il terreno e la doxiciclina ogni giorno fino al giorno 5.
4. Giorno 5: Dissociazione cellulare con reagente di dissociazione cellulare (vedi Tabella dei materiali).
   1. Sciacquare le cellule con PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libero).
   2. Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare (0,35 mL per una piastra da 35 mm) e incubare a 37 °C fino a quando l'intero monostrato cellulare si separa dalla capsula.
      NOTA che le singole cellule non verranno separate durante l'incubazione.
   3. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 e raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL.
   4. Completare delicatamente la separazione cellulare pipettando su e giù con un pipettatore P1000 10-15 volte.
   5. Aggiungere 4 mL di DMEM/F12 e contare le cellule.
   6. In questa fase, congelare i progenitori dei motoneuroni in un mezzo di congelamento cellulare (vedi Tabella dei materiali), secondo le istruzioni del produttore.
   7. Pellettare le cellule e risospendere in Neuronal Medium (terreno Neurobasal/B27 integrato con 20 ng/mL di BDNF, 10 ng/mL di GDNF e 200 ng/mL di acido L-ascorbico, vedere la Tabella dei materiali) integrato con 10 μM di inibitore di ROCK.
   8. Seminare le cellule su poli-ornitina/laminina- o in alternativa su supporti rivestiti di matrice a 100.000 cellule/cm² di densità. Utilizzare supporti in plastica μ-Slide con vetrino coprioggetti in polimero (vedi Tabella dei materiali) per l'analisi di immunocolorazione.
5. Il giorno 6, cambiare il terreno con un mezzo neuronale fresco privo di inibitore ROCK. Nei giorni successivi, rinfrescare metà del terreno ogni 3 giorni. Il terreno di coltura deve essere cambiato con molta attenzione per evitare che si stacchi dalla superficie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Reagente per dissociazione cellulare
B27	Miltenyi Biotec	Codice 130-093-566	Integratore senza siero per il mantenimento delle cellule neuronali
Bambanker	Genetica Nippon	NGE-BB02	Mezzo di congelamento cellulare, utilizzato qui per i progenitori dei motoneuroni
BDNF	PreproTech	450-02	Fattore neurotrofico derivato dal cervello
Blasticidina	Sigma-Aldrich	Codice 203350	Antibiotico nucleosidico che inibisce la sintesi proteica nei procarioti e negli eucarioti
Bsa	Sigma-Aldrich	Codice A2153	Albumina sierica bovina. Agente bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi nei saggi di immunocolorazione
CaCl2	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C3881	Prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
Matrice qualificata Corning Matrigel hESC	Corning	354277	Prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
MEZZI DI CONGELAMENTO CRYOSTEM ACF	Industrie Biologiche	05-710-1E	Mezzo di congelamento per iPSC umane
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G5146	Prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
REPARTO	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Inibitore della gamma secretasi
Dispase	Gibco	Codice 17105-041	Reagente per la dissociazione delicata di iPSC umane
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Terreno basale per colture cellulari
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Utilizzato per indurre l'espressione di transgeni da vettori epB-Bsd-TT-NIL e epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Linea iPSC umana commerciale
GDNF	PreproTech	450-10	Fattore neurotrofico di derivazione gliale
Gibco Linea HiPSC Episomiale	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A18945	Linea iPSC umana commerciale
Glutamax	Thermo Fisher Scientifico	35050038	Un'alternativa alla L-glutammina con una maggiore stabilità. Migliora la salute delle cellule.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Prodotti chimici per soluzioni elettrofisiologiche
Acido L-ascorbico	Laboratori LKT	Codice: A7210	Utilizzato in coltura cellulare come antiossidante
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientifico	11140035	Aminoacidi non essenziali. Utilizzato come integratore per terreni di coltura cellulare, per aumentare la crescita e la vitalità cellulare.
Kit Neon 100 μL	Thermo Fisher Scientifico	MPK10096	Kit di elettroporazione cellulare
Sistema di trasfezione al neon	Thermo Fisher Scientifico	MPK5000	Sistema di elettroporazione cellulare
Terreno neurobasale	Thermo Fisher Scientifico	21103049	Terreno basale progettato per il mantenimento e la maturazione a lungo termine di popolazioni di cellule neuronali senza la necessità di uno strato di alimentazione degli astrociti
NutriStem-XF/FF	Industrie Biologiche	05-100-1A	Terreno di coltura iPSC umano
Pbs	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco, con calcio, con magnesio
PBS senza Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio
Penicillina/Streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Soluzione di penicillina/streptomicina utilizzata per prevenire la contaminazione da batteri in coltura cellulare.
poliornitina	Sigma-Aldrich	P4957	Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5 MG	Inibitore selettivo del recettore 2 del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil- polietilenglicole, t- Ottilfenossipolietossietanolo, Polietilenglicole terz- ottilfeniletere Utilizzato per la permeabilizzazione cellulare nei saggi di immunocolorazione
Y-27632 (inibitore ROCK)	Enzo Scienze della Vita	ALX-270-333-M005	Inibitore selettivo permeabile alle cellule della proteina chinasi (ROCK) associata a Rho-spirale, contenente bobina arrotolata. Aumenta la sopravvivenza delle iPSC
μ-Slide 8 pozzetti	Ibidi	Codice 80826	Supporto per l'analisi microscopica di fascia alta di cellule fissate