Generazione di un modello 3D di co-coltura di fibroblasti e neuroni corneali umani

Abstract

Fonte: Sharif, R., et al. Ingegneria del tessuto corneale: un modello in vitro delle interazioni stromale-nervose della cornea umana. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra una tecnica per generare un sistema modello di co-coltura tridimensionale di fibroblasti corneali umani primari e cellule neuronali differenziate. Questo sistema di co-coltura può essere utilizzato per studiare le interazioni stromale-nervo.

Protocollo

1. Coltura primaria di HCF (fibroblasti corneali umani) e assemblaggio di costrutti 3D

1. Assemblare costrutti 3D da espianti precedentemente coltivati in EMEM 10% FBS 1% Antibiotico/Antimicotico, passaggio e conteggio HCFs.
2. Seminare circa 1 x 10⁶ cellule/pozzetto di HCF primari su inserti di membrana in policarbonato con pori da 0,4 μm dai costrutti 3D, insieme a 1,5 mL di EMEM 10% FBS 1% antibiotico/antimicotico fresco nella parte superiore del costrutto. Aggiungere altri 1,5 ml dello stesso terreno alla base di ciascun costrutto.
3. Dopo 24 ore di semina cellulare, coltivare le cellule con EMEM 10% FBS 1% antibiotico/antimicotico, stimolato con 0,5 mM di acido 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ascorbico (vitamina C) aggiungendo 1,5 mL sulla parte superiore e 1,5 mL sul fondo di ciascun costrutto.
4. Mantenere le colture in un incubatore a 37 °C, 5 % di CO₂ per 3 settimane e fornire terreni freschi a giorni alterni durante l'intero periodo di studio. Non è necessario alcun ulteriore passaggio.

2. Differenziazione cellulare e co-colture

1. Dopo 3 settimane, aggiungere 8 x 10³ cellule/pozzetto di cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y sopra i costrutti 3D precedentemente assemblati contenenti 1,5 mL di EMEM contenente il 10% di FBS, l'1% di antibiotico/antimicotico e 0,5 mM di acido 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ascorbico (vitamina C).
   1. Lasciare che le cellule del neuroblastoma SH-SY5Y crescano sopra le cellule stromali della cornea per almeno 24 ore prima di iniziare la differenziazione cellulare.
2. Avviare la differenziazione cellulare SH-SY5Y stimolando le cellule con EMEM contenenti l'1% di FBS e 1,5 mL di acido retinoico 10 μM sopra il costrutto. Aggiungere 1,5 mL di EMEM 10% FBS 1% Antibiotico/Antimicotico 0,5 mM 2-O-α-D-glucopiranosil-L-acido ascorbico (Vitamina C) sul fondo del costrutto. Si noti che la fase dell'acido retinoico deve essere eseguita al buio.
   1. Continuare a coltivare le cellule in questo mezzo di differenziazione per 5 giorni.
3. Quando le cellule raggiungono la fase di differenziazione, passare a 1,5 ml di terreno privo di siero contenente 2 nM di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e l'1% di antibiotico/antimicotico aggiunto all'EMEM, aggiungendo alla parte superiore del costrutto. Aggiungere 1,5 mL di EMEM 10% FBS 1% Antibiotico/Antimicotico 0,5 mM 2-O-α-D-glucopiranosil-L-acido ascorbico (Vitamina C) sul fondo del costrutto. Si noti che il passaggio BDNF deve essere eseguito al buio.
4. Coltivare le cellule per altri 2 giorni prima di elaborarle per ulteriori analisi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione tamponata con fosfato di Dulbecco (1X)	Gibco di Life Technologies	Codice 14190-144
Pinze sterili	Fischer Scientific	13-812-42	Fisherbrand Pinze per schegge a punta extra fine
Lamette da barba a filo singolo	Personna	Codice 270100
Lame per bisturi chirurgiche sterili n.10	Lama chirurgica Feather	Codice: 2976#10
Eagle's Minimum Essential Medium	ATCC	30-2003
Siero fetale bovino	Atlanta Biologicals	S11550	Per la preparazione dei terreni è richiesto il 10% di FBS
Antibiotico-antimicotico (100X)	Gibco di Life Technologies	Codice 15240-062	L'1% di antibiotico-antimicotico è necessario per la preparazione dei terreni
0,05% tripsina EDTA (1X)	Gibco di Life Technologies	25300062
Inserti in membrana in policarbonato con pori da 0,4 μm	Costar di Corning	Telefono 3412
Acido 2-O-α-Dglucopiranosil-L-ascorbico (Vitamina C)	Sigma-Aldrich	SMB00390-14	Per lo studio deve essere utilizzata una concentrazione di 0,5 mM
SH-SY5Y Cellule di neuroblastoma	ATCC	SHSY5YATCC CRL-2266
Acido retinoico	Sigma-Aldrich	SRP3014-10UG	È necessario utilizzare la concentrazione finale di 10uM
BDNF	Sigma-Aldrich	R2625-100MG	È necessario utilizzare la concentrazione finale di 2nM
Dimetilsolfossido (DMSO)	VWR-Alfa Aesar	67-68-5	DMSO sterile di grado ultra puro da utilizzare
Thermo Scientific Nunc Colture Cellulari Trattate EasYFlask (T25)	Fisher Scientifico	12-565-351
Thermo Scientific Nunc Colture Cellulari Trattate EasYFlask (T75)	Fisher Scientifico	12-565-349