Immunocolorazione tissutale per citometria di massa per imaging

Abstract

Il video descrive la preparazione di un campione di tessuto per l'imaging della citometria di massa. Il tessuto viene prima elaborato per smascherare gli epitopi dell'antigene, permeabilizzare le cellule e bloccare i siti di legame degli anticorpi non specifici. Quindi, il tessuto viene incubato con un cocktail di anticorpi coniugati con metallo e una colorazione nucleare. Infine, il campione di tessuto trattato viene analizzato utilizzando uno scanner ottico.

Protocollo

1. Pretrattamento tissutale:

Per i fazzoletti freschi congelati:

1. Mettere un barattolo di vetro Coplin nel congelatore a -20°C per almeno un'ora prima dell'uso.
2. Togliete i vetrini dal congelatore a -80°C e metteteli nel barattolo di vetro Coplin nel congelatore a -20°C per almeno 15 minuti.
3. Sotto la cappa aspirante, utilizzare un tagliafiale per aprire l'ampolla di vetro al 16% di paraformaldeide (PFA). Gettare il vetro rotto in modo appropriato.
4. Aggiungere 10 mL di PFA al 16% e 30 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un barattolo di plastica Coplin. Assicurarsi che il PBS sia pre-raffreddato a 4°C.
5. Trasferire questa soluzione in frigorifero a 4°C per almeno 15 minuti.
6. Dopo 15 minuti, trasferire il barattolo di vetro Coplin con i vetrini in frigorifero a 4°C per 10 minuti.
7. Trasferire i vetrini dal barattolo di vetro al barattolo di plastica Coplin contenente la soluzione fredda di PFA al 4%.
8. Fissare i vetrini con il 4% di PFA per 30 minuti all'interno del frigorifero.
9. Sciacquare tre volte i vetrini a temperatura ambiente PBS per 5 minuti ciascuno, assicurando un risciacquo accurato tra i cicli.

Per i fazzoletti FFPE:

1. Iniziare con le sezioni di tessuto da 5 μm fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE) montate sui vetrini standard del microscopio caricati positivamente.
2. Decerare i vetrini riscaldandoli a 60°C per un'ora.
3. Rimuovere i vetrini e raffreddarli a temperatura ambiente per circa 5 minuti.
4. Posizionare i vetrini in una busta per vetrini e sciacquarli in un bagno di xilene per 3 minuti, due volte.
5. Ancora una volta, sciacquare i vetrini con etanolo al 100% per 1 minuto, due volte.
6. Allo stesso modo, sciacquare i vetrini con etanolo al 95% e al 70% per 1 minuto ciascuno.
7. Infine, risciacquare due volte in acqua distillata per 3 minuti.
   nota: L'Hyperion non può ablare entro 2 mm dal bordo del vetrino, centrando il tessuto il più possibile.

2. Recupero di epitopi indotto dal calore (HIER)

1. Preparare il tampone pH9 dell'acido tris-etilendiamminetraacetico (EDTA):
   1. Il tampone Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER viene acquistato a 100x e diluito a 1x in acqua per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
   2. Es: 2,5 ml di Abcam ab93684 in 247,5 ml di acqua HPLC.
      nota: Non utilizzare tampone più vecchio di sei mesi.
2. Allestire una camera di decloaking per riscaldare i vetrini. Per prima cosa, riempi il fondo della camera con 500 ml di acqua di rubinetto. Quindi, aggiungere 250 ml di acqua del rubinetto in entrambi i contenitori laterali e 200 ml di acqua del rubinetto nel contenitore centrale.
3. Posiziona fino a 3 diapositive in una busta per vetrini a 5 posti.
4. Riempire il caricavetrino con il tampone HIER fino a quando il tessuto non è completamente sommerso. nota: Assicurarsi che la busta scorrevole abbia un piccolo foro nella parte superiore per far sfogare il vapore e prevenire la pressurizzazione.
5. Eseguire il "Programma 4" per 20 minuti a 95 °C.
6. Nel frattempo, preriscaldare le camere di incubazione per le fasi successive (fare riferimento al passaggio 3.5)
7. Dopo l'incubazione, rimuovere la busta e metterla in una vasca con acqua fredda dal rubinetto.
8. Lasciar raffreddare per 5 minuti.
9. Rimuovere metà del tampone dalla busta e sostituirlo con acqua distillata. Lasciar raffreddare per 5 minuti.
10. Rimuovere gradualmente il tampone e aumentare il volume dell'acqua due volte, ciascuna con un periodo di raffreddamento di 5 minuti.
11. Infine, sciacquare i vetrini con acqua distillata al 100%.

3. Bloccare l'associazione non specifica

1. Preparare il tampone di blocco (soluzione salina tamponata con Tris o TBS, Triton X-100 allo 0,1%, albumina sierica bovina al 3% o BSA) aggiungendo 150uL di TBS con BSA al 10% a 350uL di TBS con Triton X-10.
   nota: Il TBS con il 10% di BSA viene conservato a -20 °C e deve essere scongelato fresco ogni volta.
2. Utilizzando una busta per vetrini o barattoli Coplin, lavare i vetrini per 5 minuti in TBS, 0,1% Triton X-100 due volte.
3. Rimuovere il vetrino dal mailer e utilizzare un panno Kim per rimuovere eventuali tamponi al di fuori del cerchio PAP. Lasciare asciugare leggermente ~1 minuto.
4. Utilizzando un P200, aggiungere alcune gocce di tampone bloccante sul tessuto, quanto basta per coprirlo. La linea PAP deve mantenere il liquido sopra il tessuto.
   nota: Se il tampone non è confinato nel cerchio PAP, ridisegnare il cerchio PAP attorno al tessuto per prevenire la successiva perdita di anticorpi.
5. Incubare il vetrino a temperatura ambiente in una camera di umidità per 1 ora.
   nota: Una scatola di puntali per pipette vuota funziona bene per una camera di umidità. Assicurarsi che sul fondo sia presente una piccola quantità di acqua del rubinetto.

4. Colorazione con anticorpi coniugati con metalli

1. Rimuovere gli anticorpi metallo-coniugati a 4°C e centrifugare a 10.000 x G per 1 minuto.
2. Preparazione della diluizione ottimale della master mix di anticorpi in TBS, Triton X-100 allo 0,1% e miscela BSA all'1%.
   NOTA: a) La diluizione ottimale di ciascun anticorpo deve essere determinata sperimentalmente ed è uno dei passaggi più critici per il successo degli esperimenti di citometria di massa per imaging. Utilizza un foglio di calcolo Excel per calcolare i volumi. Produrre solo leggermente più del necessario a causa del costo degli anticorpi. Ad esempio, se sono necessari 200 uL di tampone di blocco, creare una master mix da 250uL. b) La miscela master deve essere preparata fresca per ogni esperimento durante la fase di blocco.
3. Dopo l'incubazione (fare riferimento al passaggio 3.5), rimuovere il vetrino dall'incubatrice.
4. Rimuovere il tampone di blocco in eccesso picchiettando il vetrino verticalmente e orizzontalmente sulle salviette Kim. Questo dovrebbe lasciare un po' di tampone bloccante sul tessuto, ma ne rimuoverà la maggior parte.
5. Lasciare asciugare leggermente ~1 minuto.
6. Posizionare il vetrino nella camera di umidità a 4°C e lasciarlo equilibrare.
7. Quindi, pipettare con cura la miscela master di anticorpi sul tessuto, facendo molta attenzione che la soluzione sia contenuta all'interno del cerchio PAP.
8. Chiudere la camera di umidità e incubare per una notte a 4°C.
9. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere il vetrino da 4°C e rimuovere la miscela master in eccesso picchiettando il vetrino verticalmente e orizzontalmente sulle salviette Kim.
10. Posizionare il vetrino nella busta o nel barattolo Coplin; lavare per 5 minuti con soluzione fisiologica tamponata con fosfato o PBS, integrato con Triton X-100 allo 0,2%, due volte.
11. Quindi, lavare il vetrino in PBS per 5 minuti, due volte. Rimuovere il vetrino e lasciarlo asciugare per circa 1 minuto.

5. Intercalazione del DNA

1. Per l'intercalazione del DNA, diluire l'Intercalator-Ir 1:1000 in PBS.
2. Pipettare con cura l'intercalatore diluito sul tessuto, facendo molta attenzione che la soluzione sia contenuta all'interno del cerchio PAP.
3. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente nella camera di umidità utilizzata per il blocco.
4. Successivamente, picchietta le diapositive verticalmente e orizzontalmente sulle salviette Kim per rimuovere il colorante Intercalator-Ir in eccesso.
5. Posizionare il vetrino nella busta o nel barattolo Coplin e lavare due volte con acqua HPLC per 5 minuti ciascuno.
6. Asciugare i vetrini in un essiccatore per 5 minuti prima di eseguire la scansione.

6. Scansione delle immagini

1. Per la scansione delle diapositive, utilizzare un incisore per vetro con punta in metallo duro per graffiare quattro X deboli nella diapositiva. Punti di insegnamento precisi consentiranno la migliore registrazione dell'immagine.
   nota: Non avvicinarsi troppo al bordo.
2. Scansione con uno scanner per documenti piano a una velocità non inferiore a 1200 punti per pollice
3. Ritaglia l'immagine il più vicino possibile ai bordi della diapositiva e salvala su un'unità flash.
4. Per la co-registrazione dell'immagine, scansionare il vetrino su un Hamamatsu NanoZoomer con "Pre_IMC" nel nome del file.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica della procedura di immunocolorazione tissutale per la citometria di massa per imaging

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzature
Barattoli Coplin
Busta postale a 5 vetrini in plastica con foro di sfiato
Dispositivo di recupero dell'antigene (camera di decloaking)
scanner
Sostanze chimiche ed enzimi:
xilene
Etanolo a 200 gradi
Acqua HPLC
Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Buffer
Tbs
TBS con Trition X-100 allo 0,1%
TBS con il 10% di BSA
Pbs
PBS con Trition X-100 allo 0,2%