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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione della fetta
- Costruisci o ottieni una camera di recupero delle fette.
NOTA: Il principio di una camera di recupero è semplice e può essere realizzato in laboratorio (Figura 1). In breve, la camera è un recipiente in cui viene inserito un cestello per contenere le fette di cervello a un livello inferiore alla superficie del liquido cerebrospinale artificiale (aCSF).
- Ad esempio, procurarsi quattro anelli (4 - 6 mm di altezza) (Figura 1A, vista laterale; B, vista dall'alto) tagliando una siringa da 30 cc. Quindi, incollare le reti tese (ad esempio, tagliate da un tubo di nylon) su un lato degli anelli per tenere le fette di cervello (Figura 1B) e incollare gli anelli insieme.
NOTA: È possibile utilizzare una pistola per colla.
- Una volta incollati i quattro anelli, incollare una parete di plastica curva isoscele di forma trapezoidale a due degli anelli (Figura 1A e B) per deviare le bolle di ossigeno dalle fette di cervello in via di recupero (Figura 1C e D). Come mostrato nella Figura 1D, inserire un sistema di diffusione dell'ossigeno (qui, un tubo di dispersione del gas) sullo stesso lato delle pareti di plastica.
- Prima dell'affettatura, ossigenare (95% O2/5% CO2) e raffreddare la soluzione di affettatura (vedere passaggio 1.4) a 0 - 2 °C.
- Riempire la camera di recupero personalizzata con aCSF standard a temperatura ambiente (RT). Assicurarsi che l'aCSF sia ben ossigenato (20 - 30 minuti, il tempo può variare in base al volume della camera) prima di posizionare le fette nella camera di recupero. Assicurarsi che le bolle di gas non entrino in contatto diretto con le fette o le interrompano.
- Foderare la vaschetta del ghiaccio con il vibratomo con ghiaccio e riempirla con acqua fredda in modo che da un terzo alla metà della camera di affettatura sia sommersa. Posizionare con cura un sistema di erogazione dell'ossigeno (ad es. una pietra che diffonde il gas) e una sonda di temperatura nella camera di affettatura in modo che nessuno degli oggetti interferisca con il movimento della lama o la manipolazione della fetta.
- Preparare l'area di dissezione e gli strumenti necessari per estrarre il cervello e sezionare la regione cerebrale desiderata.
NOTA: L'esatta dissezione eseguita dipenderà dalla specifica regione cerebrale studiata, poiché diverse strutture cerebrali richiederanno il taglio su piani diversi (ad esempio, fette coronali, sagittali o orizzontali).
- Posiziona i seguenti strumenti su un sottopiede: forbici per decapitazione, bisturi, piccole forbici a punta dritta e affilata, pinze per incannulamento dei vasi (o qualsiasi strumento chirurgico con una punta larga, come i rongeurs, che è più adatto per i teschi di ratto), pinze emostatiche curve, pinzette, spatola, spatola per raccogliere, carta da filtro, piastra di Petri, lama di rasoio a filo singolo e colla cianoacrilica.
- Quando la temperatura raggiunge 0-2°C, trasferire la soluzione di affettatura nella camera di affettatura (vassoio tampone).
- Anestetizzare il topo in una camera di essiccazione utilizzando isoflurano. La quantità esatta può variare in base alle dimensioni della camera utilizzata, ma per una piccola gabbia da scarpe, utilizzare alcune gocce (~3-4). Lasciare il topo nella gabbia fino a quando non diventa immobile (non risponde agli stimoli tattili; circa 15 secondi per le condizioni qui descritte). Eseguire test di pizzicamento della coda e del piede per assicurarsi che l'animale sia profondamente anestetizzato, quindi decapitare prima che il cuore smetta di battere (migliora la vitalità cellulare).
NOTA: Con un'adeguata giustificazione, alcuni laboratori ottengono l'autorizzazione ad eseguire la decapitazione da vivi al fine di ridurre al minimo i processi eccitotossici e migliorare la vitalità cellulare.
- Eseguire la dissezione.
NOTA: Il cervello deve essere estratto rapidamente (<45 sec).
- Usando il bisturi tagliare la pelle superficiale sulla parte superiore del cranio da rostrale a caudale.
- Sbucciare il cuoio capelluto su ciascun lato della testa.
- Usando piccole forbici a punta dritta e affilata, taglia la placca interparietale lungo la sutura lambdoidea per rimuovere il cervelletto. Rimuovere l'osso occipitale.
- Usando le stesse forbici, tagliare la sutura sagittale.
- Far scorrere la pinza per l'incannulamento dei vasi (o rongeurs se si rompe il cranio di un ratto) sotto ciascun osso parietale e tirare per esporre il cervello.
- Usando la pinza emostatica curva, pizzica le ossa frontali per romperle, quindi usa una pinzetta o una pinza per incannulamento dei vasi per rimuovere le ossa rotte. Tagliare e rimuovere la dura madre il più delicatamente possibile, in quanto può interferire con la dissezione.
- Fai scorrere la spatola sotto il cervello ed estraila delicatamente dal cranio. Metterlo nella camera di affettamento (vaschetta tampone) precedentemente riempita con aCSF ghiacciato. Lascia raffreddare il cervello per 1-2 minuti.
- Preparare la piattaforma di dissezione riempiendo una capsula di Petri con ghiaccio e un po' di acqua ghiacciata per consentire un maggiore contatto con la superficie. Coprite il piatto con il coperchio e adagiatevi sopra la carta da filtro. Bagnare la carta da filtro con aCSF freddo.
- Una volta che il cervello si è raffreddato, posizionare il cervello sulla capsula di Petri piena di ghiaccio ed eseguire rapidamente la dissezione appropriata per ottenere il piano di affettatura desiderato.
- Per ottenere fette sagittali contenenti il nucleo accumbens (NAc), utilizzare una lametta a filo singolo per tagliare e rimuovere i tubercoli olfattivi e il cervelletto se sono ancora presenti. Quindi, eseguire un taglio sagittale di 2-3 mm dal bordo laterale dell'emisfero destro per ottenere la superficie piana che verrà incollata sulla piastra portacampioni (vedi passaggio 1.8.11).
NOTA: Tagliando solo 2 - 3 mm dal bordo laterale dell'emisfero si consentirà la raccolta di fette contenenti il NAc da entrambi gli emisferi. La dissezione appropriata dipenderà dalla regione del cervello che viene indagata. Qui, la dissezione viene eseguita in modo che i neuroni NAc possano essere registrati in fette di cervello sagittale.
- Incollare rapidamente (utilizzando la colla cianoacrilica applicata alla piastra di supporto del campione) la superficie di taglio piatta del cervello sulla piastra secondo il piano di taglio desiderato. Per ottenere fette di cervello sagittale, vedere il passaggio 1.8.10.
- Posizionare e fissare immediatamente la piastra di supporto del campione nella camera di affettamento in modo che il cervello venga tagliato rostro-caudalmente (per sicurezza, installare il supporto della lama solo quando la piastra del campione è fissata).
- Impostare il vibratomo con i parametri di affettatura appropriati (parametri utilizzati in laboratorio per il vibratomo menzionato in Materiali: velocità 3 - 4, vibrazione 9-10 e spessore della fetta 250 μm).
- Dopo l'affettatura, utilizzare una pipetta di trasferimento rifinita in plastica per trasferire le fette di cervello nella camera di recupero (a RT) (vedere il passaggio 1.3). Il tempo di recupero può variare a seconda del tipo neuronale che si sta studiando (in genere 30 - 90 minuti).
2. Registrazione delle micropipette e preparazione del rig
- Fare riferimento alle linee guida specifiche del manuale dell'utente dell'estrattore per ottenere le proprietà desiderate della micropipetta.
NOTA: Per gli MSN, utilizziamo un intervallo di resistenza delle pipette di 3,2-4,0 MΩ.
- Ossigenare l'aCSF e regolare il flusso a 2 ml/min. Aspirare l'aCSF utilizzando una pompa peristaltica o le linee del vuoto installate nell'impianto.
- Accendere il controller del riscaldatore a perfusione e regolare le impostazioni della temperatura per ottenere la temperatura desiderata (ad es. 31,8-32,2 °C).
NOTA: La stabilità della temperatura dipende dall'avere sia un livello di aCSF costante che una velocità del flusso costante nella camera. Poiché diverse proprietà biofisiche dei neuroni (ad esempio, resistenza all'input, Ri, chiamata anche resistenza di membrana, Rm) sono sensibili alla temperatura, è importante mantenere una temperatura stabile.
- Accendi l'amplificatore, la fotocamera, il micromanipolatore e la luce di fondo del microscopio controllati dal computer. Se si esegue un esperimento che richiede la stimolazione elettrica del tessuto, accendere il controller dello stimolo e l'unità di isolamento.
NOTA: Alcuni amplificatori di altri produttori consigliano un "riscaldamento" prima dell'uso, quindi si consiglia di consultare il manuale per l'esatta procedura operativa.
- Avvia l'acquisizione della telecamera, l'acquisizione del segnale e il software dell'amplificatore.
- Posizionamento e visualizzazione delle fette:
- Utilizzando una pipetta di trasferimento con punta tagliata in plastica, aspirare delicatamente una fetta di cervello dalla camera di recupero.
- Posizionare la pipetta di trasferimento nella camera di registrazione e spremere delicatamente la fetta dalla pipetta sul vetrino coprioggetti che riveste il fondo della camera.
NOTA: Finché non si verifica un trabocco, è innocuo avere un po' di aCSF dalla camera di recupero che si riversa nel bagno.
- Usa una pinza per modificare la posizione della fetta in modo che l'area desiderata venga posizionata esattamente al centro della camera di registrazione. Utilizzare l'obiettivo a bassa potenza (4X) del microscopio e l'oculare per assistenza nel posizionamento.
- Dopo aver raggiunto la posizione desiderata, fissare la posizione della fetta cerebrale con un fermo della fetta (noto anche come "arpa") nella camera.
- Passare alla lente dell'obiettivo ad alta potenza (40X) e abbassarla delicatamente fino a quando non si forma il contatto con l'aCSF nella camera.
- Utilizzare la rotella di regolazione fine per mettere a fuoco il tessuto. Mentre si è a contatto con l'aCSF, non utilizzare la rotella di regolazione grossolana del microscopio poiché abbassare eccessivamente la lente dell'obiettivo può schiacciare la fetta o addirittura rompere il vetrino coprioggetto che riveste il fondo della camera, causando la fuoriuscita di aCSF sul condensatore e danneggiandolo.
- Quando l'attenzione è a livello tissutale, osservare le cellule nella regione mirata per la forma. Le cellule morte sono facilmente identificabili dalla membrana plasmatica e dal nucleo rigonfi (Figura 1E). Le cellule sane dovrebbero apparire come strutture omogenee rotonde, ovoidali o ellittiche (Figura 1E).
- Cerca una cella di destinazione. Contrassegnarlo sullo schermo del computer per facilitare la guida della micropipetta di registrazione. Se si utilizza un software come QCapture, disegnare un quadrato attorno alla cella di destinazione tenendo premuto il tasto sinistro del mouse.
- Sollevare la lente dell'obiettivo in modo che ci sia spazio sufficiente nel cono formato dalla lente dell'obiettivo a contatto con l'aCSF per posizionare e spostare la micropipetta di registrazione.
- Posizionamento e posizionamento delle micropipette
- Utilizzando una siringa da 1 ml, un ago per microsiringa non metallico e un filtro dedicato, riempire una micropipetta con la soluzione interna preparata in anticipo secondo l'esperimento pianificato (soluzione interna a base di K+ o Cs+, vedere Materiali per la composizione). Utilizzare una quantità sufficiente di soluzione in modo che la soluzione interna entri in contatto con l'elettrodo a filo d'argento rivestito di cloruro all'interno del supporto per micropipette.
NOTA: L'elettrodo a filo d'argento può essere clorurato immergendolo in candeggina per uso domestico. I nucleosidi trifosfati (adenosina trifosfato, ATP e guanosina trifosfato, GTP) possono essere aggiunti alla soluzione interna prima dell'uso. Tenere la siringa contenente la soluzione sul ghiaccio per evitare la degradazione dell'ATP/GTP.
- Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella micropipetta, poiché possono fuoriuscire mentre la micropipetta è nel fazzoletto e oscurare la fetta.
- Posizionare la micropipetta nel portaelettrodo in modo che la soluzione entri in contatto con l'elettrodo a filo rivestito di cloruro d'argento.
- Serrare il tappo della pipetta in modo che la rondella a cono formi una tenuta attorno alla micropipetta.
- Applicare una pressione positiva prima di immergere la micropipetta nell'aCSF per evitare che i detriti entrino nella pipetta.
- Posizionare l'headstage in posizione bloccata (rivolto verso la camera) e, utilizzando il micromanipolatore, guidarlo verso il basso verso la camera in modo che si trovi all'incirca sotto il centro dell'obiettivo immerso.
- Mentre si sposta la micropipetta con il micromanipolatore (impostato su velocità medio-alta), utilizzare lo schermo del computer per localizzare la micropipetta e guidarla verso la posizione della cella sull'asse X-Y.
- Misurare la resistenza della micropipetta applicando un passo di tensione (ad esempio, 4 mV per 100 msec), che può essere eseguito manualmente o automaticamente tramite un software specifico come la modalità "bagno" se si utilizza il "Test della membrana" nel software Clampex (vedere anche il passaggio 4). Per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria o altri corpi estranei che ostruiscano la micropipetta, applicare una pressione positiva utilizzando la siringa riempita d'aria (ad es. siringa da 30 cc) collegata al supporto della micropipetta con tubo in polietilene.
- Dopo aver pulito la micropipetta, eseguire un offset di tensione per ridurre a zero la corrente della pipetta, che può essere eseguita manualmente o tramite un software specifico come "offset della pipetta" sul comandante dell'amplificatore controllato da computer.
NOTA: Questa funzione compenserà qualsiasi tensione causata da differenze di concentrazione tra il bagno e le soluzioni di micropipetta (ad esempio, potenziale di giunzione del liquido).
3. Test della membrana
NOTA: Questo passaggio si applica all'amplificatore menzionato nei Materiali.
- Quando si utilizza un comandante dell'amplificatore controllato da computer, impostarlo sempre in modalità voltage-clamp per eseguire il test della membrana.
NOTA: Quando il test della membrana è impostato in modalità "Bagno", il test della membrana consente di misurare la resistenza della micropipetta e la resistenza della tenuta quando la guarnizione è formata.
- Una volta che la membrana è rotta (vedere il passaggio 4.8), passare il test della membrana alla modalità "Cella" in modo da poter ottenere la resistenza in serie (Rs) (chiamata anche resistenza di accesso, Ra), Ri e la capacità della membrana (Cp).
4. Approccio finale, formazione del sigillo e ottenimento della configurazione dell'intera cella
- Utilizzando la rotella di messa a fuoco fine, iniziare a mettere a fuoco verso il basso abbassando gradualmente la micropipetta. Mettere sempre a fuoco prima verso il basso, quindi abbassare la micropipetta fino al piano di messa a fuoco. In questo modo si garantisce che la punta della micropipetta non penetri bruscamente nella fetta.
- Quando la micropipetta entra in contatto con la superficie della fetta, rallentare la velocità del micromanipolatore in modalità medio-bassa.
- Applicare delicatamente una leggera pressione positiva con la siringa piena d'aria collegata al supporto della pipetta per rimuovere eventuali detriti dal percorso di avvicinamento.
- Avvicinarsi alla cella sia alternandosi con le manopole di comando X-Y-Z, sia avvicinandosi in diagonale (se il modello di micromanipolatore lo consente) dove entrambi gli assi X-Z vengono modificati con la rotazione della manopola dell'asse Z. Quest'ultimo metodo impedirà la compressione verticale del tessuto.
NOTA: Qui, l'obiettivo è avvicinarsi alla cella infliggendo il minimo danno alla fetta. Quando la micropipetta è abbastanza vicina alla cellula, appare una fossetta (uno scolorimento rotondo della superficie cellulare causato dalla pressione positiva applicata attraverso la punta della micropipetta) (Figura 2).
- Quando appare la fossetta (Figura 2-1), applicare un'aspirazione debole e breve attraverso il tubo collegato al tubo di aspirazione del supporto della pipetta per creare la tenuta (Figura 2-2). Continua a monitorare il test della membrana.
NOTA: Se si forma una tenuta parziale (<1 GΩ), l'iniezione di correnti negative abbassando il potenziale di tenuta (sul comandante dell'amplificatore controllato da computer) può facilitare la formazione della tenuta e raggiungere la resistenza gigaohm ("gigaohm seal" o "gigaseal" >1 - 5 GΩ). L'elevata resistenza della guarnizione (>1 GΩ) limiterà la contaminazione del rumore al segnale registrato e contribuirà alla stabilità meccanica del cerotto.
- Durante la formazione di un gigaseal, utilizzare il comandante dell'amplificatore controllato da computer per avvicinare il più possibile il potenziale di tenuta della cellula al potenziale di riposo fisiologico (riposo V) al fine di prevenire cambiamenti improvvisi una volta che la membrana è rotta. Ad esempio, gli MSN sono solitamente sottoposti a tensione bloccata a -70 o -80 mV (riposo V fisiologico: da -70 a -90 mV).
- Dopo che il gigaseal si è formato, compensare la capacità veloce e lenta manualmente o automaticamente. Se si utilizza un commander dell'amplificatore controllato da computer come il commander Multiclamp, premere 'Auto' per 'Cp Fast' e 'Cp Slow".
- Se la tenuta rimane stabile e al di sopra di 1 GΩ (o iniettando meno di 10 - 20 pA per mantenere la cella al potenziale di membrana desiderato), applicare una breve e forte aspirazione attraverso lo stesso tubo del punto 4.5 per rompere la membrana plasmatica (Figura 2-3).
NOTA: questa operazione potrebbe richiedere diverse prove. Una buona rottura della membrana si ottiene quando l'aspirazione viene eseguita con una forza sufficiente in modo che la membrana rotta non ostruisca la micropipetta (che può portare a un aumento di Rs durante la registrazione), ma abbastanza debolmente da non aspirare una grande porzione della membrana o della cellula.
- Dopo aver ottenuto una configurazione corretta dell'intera cellula, monitorare regolarmente la posizione della micropipetta per valutare e correggere la deriva significativa in quanto potrebbe portare alla perdita del cerotto. L'ampiezza della deriva può variare in base a diversi fattori, ad esempio la qualità dell'installazione del rig e le forze di trazione sul palcoscenico. Idealmente, la deriva dovrebbe essere quasi inesistente.
- Passando alla modalità "Cella" nel test della membrana, è possibile visualizzare diversi parametri della cella come Ri, Rs e Cp. Monitorare questi parametri durante la registrazione.
NOTA: Tutti questi parametri possono aiutare a valutare lo stato di salute iniziale delle cellule e dei tipi di cellule (vedere la sezione "Test di membrana", passaggio 4).
