Definizione di una configurazione a cella intera tramite il metodo Patch Clamp

Abstract

Fonte: Segev, A. et al., Registrazioni di patch-clamp a cellule intere in fette di cervello.J. Vis. Exp.(2016)

Questo video mostra la tecnica del patch clamp a cellula intera in una fetta di cervello di topo. Questa tecnica stabilisce una connessione stabile tra la micropipetta e la membrana del neurone, che viene ulteriormente interrotta per stabilire una configurazione dell'intera cellula per studiare la salute del neurone e le risposte fisiologiche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione della fetta

1. Costruisci o ottieni una camera di recupero delle fette.
   NOTA: Il principio di una camera di recupero è semplice e può essere realizzato in laboratorio (Figura 1). In breve, la camera è un recipiente in cui viene inserito un cestello per contenere le fette di cervello a un livello inferiore alla superfici....

Risultati

Figura 1. Camera di recupero su misura (A-D) e un'immagine di una fetta di cervello a 400X che mostra neuroni sani e morti (E). A-D) La procedura per realizzare una camera di recupero personalizzata è descritta nel passaggio 2.1. E) Immagine di MSN del guscio mediale NAc in una fetta di cervello a 400X che mostra esempi di neuroni sani (frecce rosse) rispetto a neuroni morti.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Generatore di impulsi di stimolo isolato	A.M.P.I	Maestro-8
Unità di isolamento (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Amplificatore controllato da computer	Dispositivi molecolari	Multiclamp 700B
Sistema di acquisizione digitale	Dispositivi molecolari	Digidata 1500
microscopio	Olimpo	BX-51
Micromanipolatore	Strumenti Sutter	MPC-200
Camera e riscaldatore in linea	Strumenti Warner	TC-344B
Affettatrice a vibratomo	Leica	VT1000 S
Estrattore per micropipette	Narishige	PC-10
Telecamera per immagini	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Estrattore per pipette Narishige PC-10	Narishige	PC-10
Capillari in vetro	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (arpa)	Strumenti Warner	Codice 64-0255
Camera di taglio	Strumenti Warner	RC-26
Ago per siringa non metallico	Strumenti di precisione mondiali	MF28G67-5
Filtri per siringhe	Nalgene	Codice 176-0045
Pistola per colla	Ferramenta	diverso
Tubo di dispersione del gas	Ace Glass Inc.	diverso
Forbici per decapitazione	Ferramenta	100649198
Manico per bisturi #3	Strumenti di precisione mondiali	500236
Piccole forbici con punte affilate dritte	Strumenti di precisione mondiali	Codice: 14218
Pinze per canulazione di vasi	Strumenti di precisione mondiali	500453
Pinze emostatiche curve	Strumenti di precisione mondiali	501288
Pinzette economiche #3	Strumenti di precisione mondiali	Codice: 501976-6
spatola	Fisher Scientifico	Codice 14357Q
Spatola per scavare	Fisher Scientifico	14-357Q
Petri	Fisher Scientifico	08-747B
Carta da filtro	Deposito di laboratorio	Pannello CFP1-110
soluzioni
Soluzione interna di K-gluconato (pH 7,2–7,3, 280–290 mOsm)
K D-gluconato, 120 mM	Sigma Aldrich/varie	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/varie	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/varie	H3375
EGTA, 0,2 mM	Sigma Aldrich/varie	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/varie	Codice: M8266
Na2GTP, 0,3 mM	Sigma Aldrich/varie	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/varie	Visualizzazione del materiale A9187
Liquido cerebrospinale artificiale standard (ACSF, osmolarità ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2,5 mM	Sigma Aldrich/varie	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/varie	S7653
NaH2PO4-H2O, 1 mM	Sigma Aldrich/varie	S9638
NaHCO3, 26,2 mM	Sigma Aldrich/varie	S8875
Glucosio, 11 mM	Sigma Aldrich/varie	G8270
MgSO4-7H2O, 1,3 mM	Sigma Aldrich/varie	230391
CaCl2-2H2O, 2,5 mM	Sigma Aldrich/varie	Visualizzazione del materiale C3881
Composti aggiuntivi utilizzati per la preparazione delle soluzioni
Koh	diverso
Acido chinurenico	Sigma Aldrich/varie	K3375