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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle Soluzioni
- Liquido cerebrospinale artificiale standard (ACSF; Tabella 1)
- Utilizzare sali ad alta purezza e bicchieri di vetro puliti precedentemente sciacquati con acqua distillata due volte per preparare una soluzione fresca. Utilizzare acqua bidistillata di alta qualità per la preparazione di tutte le soluzioni extracellulari e intracellulari.
- Secondo la Tabella 1, prendere un becher da 2 L per sciogliere NaHCO3 in 500 mL di acqua e un altro per sciogliere gli altri sali per prevenire la precipitazione di ioni bivalenti. Pulire sistematicamente la spatola con acqua bidistillata e asciugarla prima di prendere un sale. Utilizzare un agitatore magnetico per omogeneizzare la dissoluzione. Aggiungere le soluzioni di entrambi i becher in un matraccio tarato appropriato e portarle al volume appropriato.
- Assicurarsi che la soluzione extracellulare finale sia completamente trasparente e senza alcuna traccia di precipitazione.
- Applicare una miscela di gas composta dal 95% di O2 e dal 5% di CO2 (gas carbogeno) con una candela microfiltrante in vetro (Ø 13 mm) 20 - 30 minuti prima di perfondere le fette. Controllare attentamente l'osmolarità (2 - 3 misurazioni consecutive) dell'ACSF con un osmometro (intervallo ottimale: 314 - 325 mOsmol/L). Conservare la soluzione rimanente dopo la preparazione a 4 °C e utilizzarla entro 3 giorni.
- Soluzione di taglio (saccarosio-ACSF; Tabella 2)
- Preparare 3 L di soluzione fresca. Usa 1 litro per preparare fette di cervello da un animale. Conservare la soluzione rimanente a 4 °C e utilizzarla entro 3 giorni.
NOTA: Alte concentrazioni di Mg2+ e basse concentrazioni di Ca2+ vengono utilizzate per ridurre la trasmissione sinaptica e una parte di NaCl viene sostituita con saccarosio per preservare il tessuto.
- Soluzioni intracellulari
- Preparare in anticipo 100 mL di soluzione per la doppia registrazione di cellule intere (Tabella 3).
- Includere il metilsolfato per ottenere un buon recupero della morfologia cellulare. Aggiungere biocitina (0,1 - 0,4%) per esaminare successivamente la morfologia del neurone. Includi un colorante fluorescente (ad es. Alexa 594 o Sulforhodamine 101 41) per seguire l'estensione dei dendriti durante la registrazione (opzionale).
- Preparare in anticipo 100 mL di soluzione per elettrodi per le registrazioni collegate alla cellula (Tabella 4). In questo caso, la soluzione interna è una soluzione ad alto K+ progettata per isolare la corrente cationica macroscopica attivata dall'iperpolarizzazione (Ih) e contiene bloccanti per gli altri canali ionici voltaggio-dipendenti.
- Conservare le soluzioni intracellulari in aliquote da 2 mL a -20 °C. Utilizzare una nuova aliquota per ogni nuova sessione di registrazione. Controllare attentamente l'osmolarità di ogni aliquota scongelata con un osmometro. Prelevare una nuova aliquota se l'osmolarità non corrisponde al valore iniziale.
- Trasferire la soluzione dall'aliquota in una siringa da 3 mL sulla cui sommità è posizionato un filtro per siringa sterile da 0,22 μm. Tenere la siringa sul ghiaccio durante la sessione di registrazione per limitare la degradazione dei suoi composti (ATP, GTP o fosfocreatina).
2. Fabbricazione e riempimento della pipetta per cerotti
- tirata
- Utilizzare un estrattore di elettrodi orizzontale e un tubo in vetro borosilicato a pareti spesse. Per le registrazioni di celle intere e collegate, utilizzare un diametro esterno di 2 mm/1 mm di diametro interno. Assicurarsi che il tubo di vetro sia assolutamente pulito.
- In caso contrario, immergere i capillari di vetro prima in un solvente organico (ad es. etanolo) e poi in acqua bidistillata. Riscaldare brevemente le estremità capillari con un bruciatore Bunsen. In alternativa, ordinare i tubi di vetro lavati e riscaldati direttamente dal produttore (vedi elenco dei materiali).
- Per le registrazioni somatodendritiche doppie, assicurarsi che la resistenza della pipetta somatica sia compresa tra 6 e 10 MΩ e tra 8 e 19 MΩ per le pipette dendritiche quando riempite con soluzione intracellulare (Tabella 3). Standardizzare la resistenza della pipetta per le registrazioni attaccate alle cellule a una resistenza di 10 MΩ per ottenere risultati comparabili lungo il dominio somatodendritico del neurone.
- Preparare pipette fresche prima di ogni sessione di registrazione (ogni giorno) o immediatamente prima del patching e utilizzarle 5 - 8 ore dopo la loro fabbricazione. Conservare le pipette in un contenitore di vetro coperto per proteggerle dalla polvere e dall'ostruzione del puntale.
- lucidatura
- Ispezionare e lucidare a caldo ogni puntale della pipetta con una microforgia per ottenere una migliore tenuta con la membrana. Prima di utilizzare la microforgia, sciogliere un minuscolo pezzo di vetro sul filamento riscaldante in platino. Sostituire questo rivestimento di vetro sul filamento di platino ogni giorno per costanza (Peter Jonas, comunicazione personale).
nota: Le pipette utilizzate per le registrazioni collegate alle celle possono essere rivestite prima della fase di lucidatura a caldo per ridurre il rumore di fondo. Per rivestire le pipette è possibile utilizzare un agente isolante come la cera dentale fusa o un elastomero siliconico.
3. Preparazione delle Fette di Cervello
- Utilizzare ratti Wistar sani di età compresa tra 16 e 19 giorni. Non utilizzare animali malsani o che soffrono di ipotermia o disidratazione. Prima di iniziare la preparazione delle fette, conservare l'animale in un luogo sicuro e silenzioso. Evita di avere altri animali nella stanza mentre prepari un animale. Manipola gli animali delicatamente.
- Versare il saccarosio-ACSF in due becher da 400 ml di polipropilene (PP) e metterli nel congelatore a -80 °C per 45 minuti. Mescolare la soluzione per ottenere una soluzione omogenea di liquido/congelato ghiacciato e posizionare i becher sul ghiaccio. Fornire la soluzione di saccarosio-ACSF con gas carbogeno utilizzando una candela microfiltrante (Ø 13 mm) in ciascun becher di PP.
- Preparare l'affettatrice e la camera di riserva
- Utilizzare un'affettatrice per tessuti di alta qualità con vibrazioni verticali estremamente basse per ridurre al minimo i danni agli strati superficiali delle fette. Fissare una lametta fresca e intera sull'affettatrice.
- Usa una nuova lama di rasoio per ogni sessione di taglio. Evitare di piegare la lama del rasoio. Non rimuovere la pellicola di grasso sulla superficie della lama del rasoio (Josef Bischofberger, comunicazione personale).
- Se disponibile, controllare la vibrazione verticale con una vibrosonda fornita dal produttore. In alternativa, utilizzare una vibrosonda su misura. Ridurre le vibrazioni verticali della pala in modo da essere il più vicino possibile a 0 μm.
- Preparare una camera di riserva da 150 ml per le fette. Versare l'ACSF standard nella camera di riserva e metterlo a bagnomaria. Alimentare la soluzione della camera di riserva con carbogeno utilizzando una candela a microfiltro (Ø 6 mm). Assicurati che le bolle di carbogeno siano il più piccole possibile.
nota: Costruire una nuova camera di riserva ogni 2 - 3 mesi per mantenere costante la qualità della fetta.
- Tagliare le fette
- In una stanza silenziosa in cui lo sperimentatore non sia disturbato o stressato, decapitare l'animale con delle forbici chirurgiche (lunghezza 150 mm) a livello del midollo cervicale.
- Taglia la pelle nella parte superiore della testa dell'animale in direzione nasale o caudale con un bisturi e rimuovila lateralmente. Taglia la parte superiore del cranio dalla parte caudale a quella nasale della testa con le forbici sottili e rimuovi lateralmente entrambe le parti del cranio. Rimuovere il cervello con una spatola sottile e immergerlo con cautela in un becher in PP contenente saccarosio-ACSF ghiacciato (0 - 4 °C) bilanciato con carbogen.
nota: Questa sequenza di passaggi deve essere eseguita il più rapidamente possibile, ma anche meticolosamente (<<1 min, circa 40 s).
- Tenere il cervello nella soluzione del becher in PP per ~2-5 minuti. Regolare la pressione del carbogono per prevenire i movimenti del cervello. Se le bolle di carboidrati sono troppo grandi, sostituire la candela del microfiltro con una nuova.
- Posizionare il cervello su una capsula di Petri di 9 cm il cui fondo interno è coperto da uno strato di Sylgard spesso ~0,5 cm. Prepara questa capsula di Petri in anticipo.
- Circonda il cervello con saccarosio-ACSF ghiacciato. Assicurarsi che una parte liquida della soluzione di ACSF-saccarosio immerga il cervello. Per le fette coronali, tagliare la parte frontale del cervello sul piano coronale con un bisturi o una lama di rasoio. Rimuovere il cervelletto con un taglio coronale.
- Applicare la colla cianoacrilica sul vassoio dei campioni (area ~1 cm2). Incolla il blocco cerebrale in modo che la parte frontale sia rivolta verso la fase di affettatura. Sgocciolare con cura il saccarosio-ACSF sopra il cervello incollato utilizzando l'ampia apertura di una pipetta di vetro Pasteur e successivamente immergere lentamente la camera di taglio dell'affettatrice. Manovrare il vassoio del campione in modo che la superficie di taglio (cioè il primo tessuto a colpire la lama) sia la superficie ventrale del cervello.
- Applicare il carbogen con una candela microfiltrante in vetro curvato (Ø 6 mm) sulla camera di taglio (opzionale).
- Regolare la lama del rasoio con un angolo di ~15° rispetto al piano orizzontale. Tagliare fette di cervello coronale di ~500 μm in direzione caudale o nasale prima di raggiungere la substantia nigra. Diminuire lo spessore per tagliare fette spesse 300 - 350 μm contenenti la regione di interesse.
- Separare le fette dal blocco di tessuto con un ago di perfusione molto sottile attaccato a una siringa parallela al bordo della lama del rasoio. Piegare l'ago in modo da avere un angolo di 90° tra l'ago e la siringa. Assicurarsi che non venga applicata alcuna pressione alla lama del rasoio durante la rimozione della fetta dal blocco di tessuto.
- Conservare le fette
- Trasferire le fette utilizzando l'apertura più grande di una pipetta di vetro Pasteur (attaccata a un bulbo) nella camera di riserva. Una volta che tutte le fette sono state trasferite nella camera di riserva (Christoph Schmidt-Hieber, comunicazione personale) portare la temperatura del bagno d'acqua a 34 °C per 0,5 - 1 h.
- Trascorso questo periodo, spegnere il bagnomaria e mantenere le fette a temperatura ambiente. Regolare la pressione del carbogeno per evitare movimenti delle fette nella camera di riserva. Conservare le fette per altri 10-20 minuti prima di iniziare le registrazioni.
- Al termine della procedura di affettatura, pulire accuratamente l'attrezzatura e le candele del microfiltro con acqua distillata doppia.
4. Registrazioni somatiche e somatodendraliche doppie nei neuroni nigrali e nella limatura della biocitina
- Seguire le descrizioni per l'assemblaggio di una configurazione patch-clamp per le fette fornite nella Guida agli assoni.
- Preparare la camera di registrazione
- Mettere 1 - 2 ml di acqua bidistillata nella camera di registrazione. Verificare che non perda. Posizionare la camera di registrazione sul tavolo x-y mobile.
- Alimentare l'ACSF standard attraverso un sistema di tubi di perfusione impermeabile all'ossigeno (politetrafluoroetilene) alla camera di registrazione. Stabilizzare il flusso di perfusione nella camera a una velocità di 4 - 5 mL min-1. Mantenere la lunghezza del tubo che unisce il becher contenente ACSF e la camera di registrazione il più corta possibile (1 m).
- Selezionare una fetta di cervello dalla camera di riserva e trasferirla nella camera di registrazione utilizzando l'apertura più grande di una pipetta di vetro Pasteur. Copri la fetta con un anello di platino per ancorarla al fondo della camera di registrazione. Utilizzare un anello piatto di platino (Ø 1,5 cm) e incollare su di esso fili di nylon paralleli (distanza >2 mm).
- Regolare e ottimizzare l'ottica
- Visualizzare le fette utilizzando la microscopia video a infrarossi (IR). Regolare l'illuminazione Köhler 51 e ottimizzare l'ottica con contrasto interferenziale differenziale (DIC) o l'illuminazione obliqua (Dodt Gradient contrast - DGC).
- Controlla la qualità della fetta. Conservare solo fette con superfici lisce e uniformi, non troppo contrastate e con solo piccoli crateri dispersi.
- Riempire 2 pipette di cerotti nuove e non utilizzate con soluzione intracellulare (Tabella 3). Utilizzare una provetta da 0,5 ml contenente la soluzione della pipetta per riempire la punta della pipetta mediante azione di capillarità. Per accelerare il riempimento del puntale delle pipette senza filamento, applicare una pressione negativa all'estremità della pipetta utilizzando un tubo collegato a una siringa.
- Posizionare le pipette sopra la superficie della fetta
- Verificare la presenza di rivestimento di cloruro sui fili d'argento.
- Inserire le pipette in sequenza nei portapipette e applicare una pressione positiva (~70 mbar) utilizzando un circuito di tubi che collega il portapipetta, un rubinetto a tre vie e un manometro. Abbassare la pipetta nel bagno della camera di registrazione.
- Verificare che il valore della pressione sul manometro sia costante per ~1 - 2 min. Se la pressione sta diminuendo, controllare il tubo o gli O-ring di tenuta all'interno del supporto della pipetta.
- Posizionare il puntale della pipetta al centro del monitor video e assicurarsi che non sia ostruito. Assicurarsi che il puntale della pipetta non si muova quando si applica o si rilascia pressione sulla pipetta.
- Verificare la presenza di deriva e vibrazioni della punta della pipetta disegnando una piccola croce al centro del monitor esattamente nella posizione della punta della pipetta e osservare per 5 minuti i possibili movimenti della punta.
- Applicare un passo di tensione (5 mV) per monitorare la resistenza della pipetta su un oscilloscopio. Impostare il potenziale di tenuta dell'amplificatore patch-clamp su 0 mV. Annullare il potenziale di offset della pipetta in modo che la corrente della pipetta CC legga zero al misuratore dell'amplificatore.
- Spostare le pipette verso il basso fino alla fetta e mantenerle sopra la superficie.
- Seleziona e patch a un neurone con dendriti lunghi
- All'interno della substantia nigra selezionare un neurone sano con dendriti lunghi che possono essere seguiti su una lunga distanza all'incirca sullo stesso piano (Figure 1A e 1B) utilizzando il contrasto a gradiente IR-Dodt (IR-DGC). Scegli un corpo cellulare liscio e omogeneo. Evitare le due celle fortemente contrastate sulla superficie della fetta (Figura 1C e 1D), perché è difficile da rodare e mantenere condizioni di registrazione stabili nel tempo (resistenza in serie stabile). Seleziona i neuroni che hanno il loro soma 10 - 30 μm sotto la superficie della fetta.
- Avvicinare l'elettrodo somatico al soma (a 40 - 50 μm di distanza) e l'elettrodo dendritico al dendrite alla stessa distanza. Utilizzare un ingrandimento 2X (caricatore quadruplo) per selezionare e applicare il patch a una porzione di un dendrite. Ottenere sul monitor un ingrandimento assoluto di 2.100X senza ingrandimento (1X) e di 5.500X con un ingrandimento 2X.
- Rilasciare leggermente la pressione della pipetta somatica di 10 mbar. Se necessario, regolare la pressione della pipetta dendritica e somatica per evitare lo spostamento della struttura cellulare (soma e dendrite) all'interno della fetta.
- Posizionare la pipetta dendritica vicino alla membrana in modo da vedere una piccola fossetta. Rilasciare la pressione sul puntale della pipetta e applicare il patch al dendrite controllando la resistenza della pipetta. In condizioni ideali, solo una leggerissima aspirazione è sufficiente per ottenere una buona tenuta.
- Ridurre il più possibile l'ampiezza dei transitori di capacità della pipetta in cima al passo di corrente utilizzando un impulso di tensione con guadagno elevato e poco filtraggio 51 e l'oscilloscopio. Entra in modalità cellula intera con la pipetta dendritica.