Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Registrazioni elettrofisiologiche per studiare l'attività spontanea e dipendente dalla stimolazione degli elettrodi
- Lavare la coltura multielectrode array (MEA) con una soluzione extracellulare, a temperatura ambiente (RT).
- Asciugare i contatti con un fazzoletto e montare il MEA sul MEA setup.
nota: Per mantenere la coltura umida durante il montaggio, aggiungere una piccola goccia di soluzione extracellulare alla coltura.
- Aggiungere 300 μl di soluzione extracellulare e attendere 10 minuti prima di registrare, per consentire al sistema di stabilizzarsi.
- Registra l'attività spontanea per 2 minuti da tutti gli elettrodi premendo il pulsante di registrazione/acquisizione del software e identifica gli elettrodi di registrazione.
- Stimolazione con elettrodi MEA: selezionare l'ampiezza/durata/forma dello stimolo sul software appropriato e applicarlo a più elettrodi consecutivamente. Selezionare gli elettrodi in base a quelli che mostrano attività spontanea (come al punto 1.4). Registra da tutti gli elettrodi rimanenti.
- Per escludere artefatti di stimolazione, stimolare dallo stesso elettrodo 10 volte. Se la coltura risponde almeno 8 volte su 10, può essere assunta come una risposta positiva alla stimolazione indotta dall'elettrodo.
- Per identificare il rumore di fondo, applicare la tetrodotossina (TTX) alla coltura a una concentrazione di 1 μM, per bloccare i canali del sodio voltaggio-dipendenti e registrare per 2 minuti. Utilizzare questa opzione per eseguire il rilevamento dei picchi (2,1 e 2,2).
2. Analisi dei dati
- Utilizzando l'apposito software si rileva l'attività spontanea per ogni elettrodo utilizzando un rivelatore basato su deviazioni standard e un discriminatore successivo. L'attività appare come transitori di tensione veloci (<5 msec).
- Scegliere una soglia che non comporti alcuna attività durante l'analisi dei campioni trattati con TTX. Adattare il valore di soglia per ogni esperimento per discriminare tra rilevamenti di falsi positivi e falsi negativi.
- Utilizzando un software appropriato, osservare l'attività neuronale rilevata di ciascun elettrodo come un grafico raster secondo le procedure standard (vedi Figura 1A-C).
- Determinare e visualizzare l'attività totale della rete sommando tutti gli eventi rilevati all'interno di una finestra scorrevole di 10 msec, spostata di 1 msec.
- Rileva l'attività indotta dalla stimolazione visualizzando i dati grezzi utilizzando un software di analisi appropriato. Identifica manualmente i singoli picchi offline. I singoli picchi appaiono come transitori di tensione veloce, che si verificano dopo l'artefatto di stimolazione (punta di freccia nella Figura 1E). Un esempio è mostrato nella Figura 1E.
- A seconda dell'esperimento, analizzare il numero di elettrodi che rispondono, la soglia necessaria per ottenere una risposta, il numero di potenziale d'azione per elettrodo e altri parametri di interesse.
