Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
NOTA: Ogni partecipante coinvolto nella procedura deve essere adeguatamente addestrato nelle procedure chirurgiche di base e deve avere una licenza valida per eseguire esperimenti sugli animali.
1. Anestesia e premedicazione
- Anestetizzare un ratto con iniezioni intraperitoneali di pentobarbital sodico (una dose iniziale di 60 mg·kg-1 per ratti Wistar maschi di 6 mesi del peso di 400\u2012550 g).
nota: Questo protocollo non è limitato al ceppo, al sesso o all'età indicati dei ratti. Inoltre, l'anestesia alternativa, come la miscela ketamina-xilazina, l'alfa-cloralosio o il fentanil+midazolam+medetomidina, può essere utilizzata se più adatta a diversi obiettivi di ricerca o quando richiesto dal comitato etico.
- Dopo circa 5 minuti, controllare la profondità dell'anestesia pizzicando il dito del ramo posteriore del ratto con una pinza smussata. Procedere con i passaggi successivi del protocollo solo quando non si osserva alcuna azione riflessa.
- Iniettare 0,05 mL di atropina per via sottocutanea al fine di ridurre la produzione di muco dopo l'intubazione.
- Iniettare per via sottocutanea 5 mL di tampone fosfato contenente una soluzione di glucosio al 4%, NaHCO3 (1%) e gelatina (14%). Questo tampone sarà assorbito dai vasi cutanei durante un esperimento e aiuterà a mantenere l'equilibrio dei liquidi.
- Durante l'intervento, controllare periodicamente l'animale per le azioni riflesse e integrare l'anestesia se necessario (10 mg·kg-1· h-1 di pentobarbital sodico).
2. Chirurgia
- Preparare l'animale per il trattamento chirurgico radendo il pelo sulla parte dorsale dell'arto posteriore sinistro, dalla caviglia all'anca, sul retro, dalla coda ai segmenti toracici alti (Th), sul lato sinistro del torace e sul lato ventrale della zona del collo sopra lo sterno
- Posizionamento della linea endovenosa
- Posiziona il ratto sulla schiena su un termoforo a circuito chiuso (e fissalo con fissaggi agli arti).
- Utilizzando una lama a 21 lame, eseguire un taglio longitudinale attraverso la pelle dallo sterno al mento.
- Tenere la pelle con una pinza e separarla dal tessuto sottostante.
- Utilizzando tecniche di dissezione smussate, esporre la vena giugulare destra. Sezionare con cura la vena dai tessuti circostanti.
- Individua la parte della vena senza punti di ramificazione e infila due legature 4-0 sotto di essa.
- Fare un nodo sciolto sull'estremità prossimale del segmento non ramificato della vena precedentemente identificato e un nodo sciolto sull'estremità distale di questo segmento della vena. Bloccare la vena prossimale al cuore, quindi legare la parte distale della vena.
- Usando le forbici dell'iride, praticare un'incisione tra il morsetto e la legatura distante. Tenere un lembo della vena e introdurre un catetere preriempito fino al punto in cui è bloccato dal morsetto.
- Tenendo insieme la vena e il catetere con una pinza, rimuovere il morsetto e spingere il catetere di diversi millimetri nella vena. Fissare entrambe le estremità del catetere alla vena e aggiungere un ulteriore punto di fissazione alla pelle.
3. Introduzione del tubo tracheale
- Usando una pinza smussata, separare le due ghiandole mandibolari che coprono i muscoli sternoioidei. Separare i muscoli sternoioidi sulla linea mediana per esporre la trachea.
- Infilare tre legature 4-0 sotto la trachea, quindi fare due nodi sotto il punto di inserimento del tubo tracheale e un nodo sopra.
- Individuare la cartilagine cricoidea della laringe e praticare un'incisione sotto la terza cartilagine tracheale.
- Inserire un tubo tracheale lungo la trachea e fissare il tubo in posizione con legature pre-preparate, quindi aggiungere un'ulteriore legatura alla pelle.
- Posizionare un piccolo pezzo di cotone idrofilo sopra i muscoli separati e suturare la pelle sopra l'area operata.
4. Dissezione dei nervi degli arti posteriori
- Con l'aiuto di una lama 21, eseguire un taglio longitudinale sul lato posteriore dell'arto posteriore sinistro, dal tendine d'Achille all'anca.
- Afferra la pelle con una pinza e, usando tecniche di dissezione smussata, separa la pelle dai muscoli sottostanti su entrambi i lati dell'incisione.
- Individua la fossa poplitea nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio, che è coperta dal muscolo bicipite femorale, e usando le forbici, fai un taglio tra la parte anteriore e posteriore di questo muscolo.
- Spostandoti verso l'alto, taglia due teste del bicipite femorale fino all'anca per esporre il nervo sciatico. Cauterizzare se necessario per prevenire il sanguinamento.
- Identificare i rami surali, tibiali e peroneali comuni del nervo sciatico.
- Usando le forbici, separare la testa laterale da quella mediale del muscolo gastrocnemio per esporre il nervo tibiale e i suoi rami.
- Usando 55 pinze, afferra l'estremità distale del nervo surale, taglialo distalmente e sezionalo il più lontano possibile.
- Ripetere la procedura con il nervo peroneo comune.
- Usando una bacchetta di vetro smussata, separare il nervo tibiale dai tessuti circostanti, facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni, e tagliarlo distalmente.
- Identificare il gastrocnemio mediale (MG) e i nervi gastrocnemio laterale e soleo (LGS).
- Utilizzando 55 pinze, sezionare attentamente i nervi MG e LGS, scollegandoli dai tessuti circostanti ma mantenendo la loro connessione con i rispettivi muscoli.
- Metti un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina sotto i nervi esposti.
- Chiudere la pelle sull'area operata.
5. Laminectomia
- Utilizzando una lama 21, praticare un'incisione longitudinale dall'osso sacro fino alle vertebre toraciche.
- Separare la pelle dai muscoli sottostanti.
- Tagliare il muscolo longissimus su entrambi i lati dei processi spinosi toracici e lombari.
- Usando un bisturi smussato, ritrarre i muscoli dalla colonna vertebrale per esporre i processi trasversali di ciascuna vertebra.
- Usando le forbici a punta smussata, taglia i tendini dei muscoli collegati ai processi trasversali lungo la colonna vertebrale esposta. Se necessario, applicare agenti emostatici.
- Identificare la vertebra Th13 come il segmento toracico più basso con l'inserzione delle costole e, utilizzando rongeurs fini, rimuovere i processi spinosi e le lamine dalle vertebre Th13 a L2 per esporre i segmenti lombari del midollo spinale. Ricordarsi di non danneggiare il processo spinoso L3, che verrà utilizzato come punto di fissaggio per la stabilizzazione della colonna vertebrale.
- Rimuovere il processo spinoso Th12 e levigare il più possibile la superficie dorsale della vertebra
.
- Utilizzando tecniche di dissezione smussata, separare i muscoli dalla vertebra Th11 per creare punti di inserimento del supporto.
- Posizionare un batuffolo di cotone sottile e imbevuto di soluzione salina sui segmenti esposti del midollo spinale.
- Sposta il ratto sul telaio metallico su misura con due barre parallele e due bracci regolabili con morsetti per sostenere e stabilizzare la colonna vertebrale.
6. Preparazione per la registrazione e la stimolazione
- Fissazione della colonna vertebrale e disposizione dei nervi
- Posiziona il ratto nel telaio su misura su un termoforo collegato al sistema di riscaldamento a circuito chiuso per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 ± 1°C.
- Inserire gli elettrodi dell'elettrocardiogramma (ECG) sotto la pelle e collegarli a un amplificatore per il monitoraggio della frequenza cardiaca.
- Usando i lembi di pelle, formare una pozza profonda sopra il midollo spinale esposto.
- Utilizzando morsetti metallici, fissare la colonna vertebrale inserendo morsetti sotto i processi trasversali Th12 e al processo spinoso L3.
- Assicurarsi che la colonna vertebrale sia fissata e disposta orizzontalmente, quindi applicare una pressione dorso-ventrale su entrambi i lati della colonna per ritrarre i muscoli.
- Riempire la piscina con olio minerale caldo (37 °C) e mantenerla a questa temperatura.
- Infilare una legatura 4-0 attraverso il tendine d'Achille, sollevare e allungare l'arto posteriore sinistro operato in modo che la caviglia sia livellata con l'anca.
- Usando i lembi cutanei, crea una pozza profonda sopra i nervi tibiale, MG e LGS esposti.
- Riempire la piscina con olio minerale caldo (37 °C).
- Posizionare i nervi MG e LGS su elettrodi stimolatori bipolari a filo d'argento e collegarli a uno stimolatore di impulsi quadrati. Utilizzare canali di stimolazione separati per ciascun nervo.
7. Posizionamento dell'elettrodo di superficie
- Posizionare un elettrodo a sfera d'argento sul lato caudale sinistro del midollo spinale esposto, con un elettrodo di riferimento inserito nei muscoli della schiena, e collegare entrambi gli elettrodi all'amplificatore CC differenziale. L'elettrodo a sfera di superficie verrà utilizzato per registrare le raffiche afferenti dai nervi.
- Utilizzando uno stimolatore a corrente costante, stimolare i nervi MG e LGS con impulsi quadrati della durata di 0,1 ms, ripetuti a una frequenza di 3 Hz, e osservare le raffiche afferenti.
- Determinare la soglia (T) per l'attivazione del nervo, stimolare ciascun nervo a circa 3.T di intensità e registrare l'ampiezza della raffica afferente per ciascun nervo.
- Spostare l'elettrodo di superficie rostrale e ripetere la procedura per identificare i segmenti spinali in cui le ampiezze delle raffiche sono più alte per ciascun nervo. Dopo aver determinato la posizione massima della raffica, spostare l'elettrodo di superficie a una distanza di sicurezza dal midollo spinale.
- Paralisi muscolare e formazione di uno pneumotorace al fine di ridurre i movimenti respiratori
- Paralizzare il ratto per via endovenosa con un bloccante neuromuscolare e collegare il tubo tracheale a un ventilatore esterno in linea con un capnometro compatibile con i roditori (bromuro di pancuronio, alla dose iniziale di 0,4 mg·kg-1, integrato ogni 30 minuti in dosi di 0,2 mg·kg-1)
- Monitorare la concentrazione di CO2 di fine espirazione e mantenerla a circa il 3-3% regolando i parametri di ventilazione (frequenza, pressione dell'aria e volumi di flusso).
- Praticare un'incisione longitudinale nella pelle tra la 5a e la 6a costola sul lato della registrazione.
- Usando le forbici a punta smussata, taglia i muscoli sovrastanti per visualizzare lo spazio intercostale tra le costole.
- Con l'aiuto di piccole forbici affilate, praticare una piccola incisione nei muscoli intercostali e nella pleura, quindi inserire la punta di una pinza a lama smussata nell'apertura, facendo attenzione a non premere sui polmoni.
- Lasciare che la pinza si espanda o inserire un piccolo tubo per mantenere aperto lo pneumotorace durante l'esperimento.
- Dopo il blocco neuromuscolare, monitorare la profondità dell'anestesia controllando la frequenza dell'ECG e integrare l'agente anestetico se la frequenza cardiaca supera i 400 bpm. Paralisi muscolare e formazione di uno pneumotorace per ridurre i movimenti respiratori che miglioreranno la stabilità della registrazione.
8. Apertura della dura madre e della pia madre
- Usando la pinza #55, sollevare delicatamente la dura madre e tagliarla caudalmente dal segmento L5, rostralmente fino al segmento L4.
- Usando un paio di pinze ultrasottili da 5SF, fare una piccola macchia nella pia che copre la colonna dorsale tra i vasi sanguigni, esattamente al livello della raffica di massima afferenza dal nervo MG o LGS.
- Utilizzare piccoli pezzi di schiuma di gel imbevuta di soluzione salina e asciugata per bloccare l'emorragia, se necessario.
9. Posizionamento dell'elettrodo per stimolazione transspinale a corrente continua (tsDCS)
- Praticare una piccola incisione nella pelle sul lato ventrale dell'addome di un ratto a livello rostrocaudale corrispondente alla posizione dei segmenti spinali lombari (L)4-L5.
- Afferra il lembo cutaneo esposto con una clip metallica, che fungerà da elettrodo di riferimento.
- Posizionare una spugna imbevuta di soluzione salina sul lato dorsale della vertebra toracica (Th) 12. Assicurarsi che la dimensione della spugna sia uguale a quella di un elettrodo tsDCS attivo (piastra in acciaio inossidabile a forma di cerchio di 5 mm di diametro).
- Utilizzando un manipolatore fine, premere la spugna con un elettrodo tsDCS attivo sull'osso e assicurarsi che l'intera superficie dell'elettrodo sia premuta allo stesso modo.
- Collegare gli elettrodi di riferimento e gli elettrodi tsDCS attivi a un'unità stimolatrice a corrente costante in grado di erogare un flusso continuo di corrente continua.
10. Preparazione delle micropipette
- Utilizzando un estrattore per microelettrodi, preparare un microelettrodo.
nota: Possono essere utilizzati sia elettrodi a filamento che non a filamento. Tuttavia, ricorda che il gambo dell'elettrodo deve essere abbastanza lungo da raggiungere il corno ventrale pur essendo abbastanza sottile da non comprimere il midollo spinale durante la discesa.
- Regolare l'impostazione dell'estrattore in modo che il gambo che entra nel midollo spinale sia lungo circa 3 mm, mentre la punta dell'elettrodo non abbia un diametro superiore a 1\u20122 μm e la resistenza del microelettrodo sia compresa tra 10 e 20 MΩ.
- Riempire i microelettrodi con elettrolita 2M di citrato di potassio.
- Montare il microelettrodo preparato sul micromanipolatore, consentendo un movimento a passi di 1-00 μm e la calibrazione stereotassica.
- Collegare il microelettrodo all'amplificatore intracellulare con l'elettrodo di riferimento posizionato nei muscoli della schiena.
- Dopo il blocco neuromuscolare, monitorare la profondità dell'anestesia controllando la frequenza dell'elettrocardiogramma (ECG) e integrare l'agente anestetico in modo che la frequenza cardiaca del ratto non superi i 400 bpm.
11. Tracciamento e penetrazione dei motoneuroni
- Riposizionare l'elettrodo di registrazione della volée afferente sulla superficie dorsale del midollo spinale, caudalmente alla posizione del sito di registrazione, a livello del segmento L6.
- Stimolare i nervi gastrocnemio mediale (MG) e i nervi gastrocnemio laterale e soleo (LGS) con impulsi elettrici di 0,1 ms a una frequenza di 3 Hz e intensità 3T per attivare tutti gli assoni degli alfa-motoneuroni all'interno di un nervo selezionato.
- Inserire la micropipetta in una zona selezionata nella pia con un angolo mediolaterale di 15-20° (con una punta diretta lateralmente).
- Dopo essere sceso sotto la superficie, calibrare il microelettrodo e compensare la sua capacità e l'offset di tensione, quindi continuare la penetrazione del midollo spinale quando tutti i parametri sono stabili. Un potenziale di campo antidromico del pool di motoneuroni sarà visibile sulla traccia di tensione del microelettrodo mentre si avvicina a un nucleo motorio dedicato durante la stimolazione del rispettivo nervo.
- Procedere con la penetrazione con il microelettrodo a passi di 1\u20122 μm e utilizzare periodicamente la funzione buzz dell'amplificatore intracellulare per liberare la punta dell'elettrodo da eventuali residui.
- Osservare la penetrazione del motoneurone, che sarà caratterizzata da un'improvvisa iperpolarizzazione della traccia di tensione registrata e dalla comparsa di un potenziale di picco antidromico.
12. Registrazione della membrana del motoneurone e delle proprietà di cottura
- In una modalità ponte dell'amplificatore intracellulare, identificare il motoneurone in base all'aspetto "tutto o niente" del potenziale d'azione antidromico stimolando i rispettivi rami nervosi. Registra 20 tracce successive per una media successiva.
- Implementare un rigoroso criterio di inclusione per garantire dati di alta qualità: potenziale di membrana a riposo di almeno -50 mV di ampiezza; ampiezze del potenziale d'azione superiori a 50 mV, con un overshoot positivo; potenziale di membrana stabile per almeno 5 minuti prima della registrazione.
- In una modalità di blocco di corrente discontinua (modalità di commutazione della corrente 4-8 kHz) dell'amplificatore intracellulare, evocare un potenziale d'azione ortodromico in un motoneurone utilizzando impulsi di corrente depolarizzante intracellulare di 0,5 ms. Ripeti almeno 20 volte per la media offline.
- Stimolare un motoneurone con 40 impulsi brevi (100 ms) di corrente iperpolarizzante (1 nA) per calcolare la resistenza di input cellulare.
- Stimolare un motoneurone con impulsi a onda quadra di 50 ms ad ampiezze crescenti per determinare il valore della reobase come l'ampiezza minima della corrente depolarizzante necessaria per suscitare un singolo picco.
- Iniettare impulsi a onda quadra di 500 ms di corrente depolarizzante, ad ampiezze crescenti in incrementi di 0,1-2 nA per evocare scariche ritmiche di motoneuroni.
13. Stimolazione transspinale a corrente continua (tsDCS)
- Mantenendo una penetrazione stabile del motoneurone, avviare la procedura di polarizzazione mediante applicazione transspinale di corrente continua. Regolare l'intensità di corrente e il tempo di applicazione in base al progetto dell'esperimento (ad esempio, 0,1 mA per 15 minuti).
- Subito dopo l'accensione del DC, osservare il potenziale di membrana del motoneurone. La polarizzazione anodica (l'elettrodo attivo come anodo) dovrebbe provocare la depolarizzazione del potenziale di membrana, mentre la polarizzazione catodica (l'elettrodo attivo come catodo) dovrebbe evocare un effetto opposto. Osservare se una variazione del potenziale di membrana a riposo in risposta alla stimolazione CC è costante, il che garantisce che l'intensità del campo elettrico non sia influenzata.
- Durante l'applicazione a corrente continua, ripetere i passaggi 5.3-6 a intervalli di 5 minuti.
- Spegnere il controller di dominio e continuare a ripetere i passaggi 5.3-6 a intervalli di 5 minuti fino a quando le registrazioni diventano instabili o i criteri di inclusione non vengono compromessi.
- Terminare l'esperimento e sopprimere l'animale utilizzando la somministrazione endovenosa di una dose letale di pentobarbital sodico (180 mg·kg-1).
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