Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Animali
NOTA: I topi sono stati ottenuti dall'Australian Rodent Centre (ARC; Perth, Australia) e tenutosi presso la Medical Foundation Building Animal Facility dell'Università di Sydney.
- Mantenere i topi su un ciclo standard di luce/buio di 12 ore con arricchimento ambientale.
- Utilizzare topi C57BL/6 maschi e femmine (3-5 settimane) per tutti gli esperimenti.
2. Preparazione delle Soluzioni
- Preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) composto da 29 mM di NaHCO3, 11 mM di glucosio, 120 mM di NaCl, 3,3 mM di KCl, 1,4 mM di NaH2PO4, 2,2 mM di MgCl2, 2,77 mM di CaCl2.
- Preparare 200 mL di saccarosio-ACSF (sACSF) contenente 29 mM di NaHCO3, 11 mM di glucosio, 241,5 mM di saccarosio, 3,3 mM di KCl, 1,4 mM di NaH2PO4, 2,2 mM di MgCl2, 2,77 mM di CaCl2. Prima di aggiungere CaCl2 all'ACSF e al sACSF, gassare le soluzioni con carbogeno (95 % O2 e 5 % CO2) per stabilire un pH di 7,4 ed evitare la precipitazione del calcio (torbidità).
- Preparare una soluzione intracellulare a base di K+ composta da 70 mM di gluconato di potassio, 70 mM di KCl, 2 mM di NaCl, 10 mM di HEPES, 4 mM di EGTA, 4 mM di Mg2-ATP, 0,3 mM di Na3-GTP, con un pH finale di 7,3 (regolato utilizzando KOH).
nota: Si raccomanda di filtrare le soluzioni intracellulari con filtri da 0,22 μm e di conservarle in aliquote da 0,5 mL a -20 °C.
3. Preparazione del tronco encefalico
- Prima dell'estrazione del tronco encefalico, equilibrare il sACSF con carbogeno e raffreddare a -80 °C per 25 minuti fino a formare un impasto di ghiaccio.
- Anestetizzare il topo con isoflurano (3-5 %) saturo di ossigeno (3 ml/min). Una volta che i riflessi della zampa posteriore sono assenti, decapita il topo con forbici affilate in acciaio inossidabile.
- Esporre il cranio praticando un'incisione sagittale nella pelle usando una lama di rasoio (#22 arrotondata).
- Usando l'estremità appuntita di un paio di forbici standard, fai una piccola incisione alla lambda e taglia lungo la fessura longitudinale.
- Rifletti attentamente le ossa parietali e occipitali accoppiate usando un paio di rongeurs di Pearson poco profondi.
nota: Durante questa procedura, il cervello viene continuamente immerso in situ utilizzando l'impasto sACSF ghiacciato precedentemente preparato.
- Isolare il tronco encefalico dal proencefalo e dal suo involucro osseo usando una lama di rasoio (#11 dritta) per tagliare il solco parieto-occipitale e il midollo caudale.
- Montare l'estremità ventrale isolata del tronco encefalico su un blocco di polistirene trapezoidale precedentemente tagliato. Utilizzare uno stoppino di carta velina per rimuovere il liquido in eccesso attorno al tessuto sezionato e garantire una buona adesione del tessuto alla fase di taglio.
nota: Il blocco di polistirene viene tagliato in una forma trapezoidale per garantire che l'estremità rostrale del mesencefalo si adatti e si assottigli nel midollo spinale.
- Utilizzare la colla cianoacrilica per fissare il blocco di polistirene con l'estremità rostrale del tronco cerebrale attaccata fino alla fase di taglio.
- Utilizzando una velocità di avanzamento di 0,16 mm/s e un'ampiezza di vibrazione di 3,00 mm, preparare fette trasversali da 200 μm del MVN.
nota: La posizione dell'MVN è determinata utilizzando l'atlante cerebrale del topo Paxinos e Franklin. La MVN (indicata come MVe nell'atlante) si trova immediatamente ventrolaterale al 4° ventricolo ed è la più grande subito prima dell'attacco del cervelletto (tra i collicoli inferiori e l'obex).
- Utilizzare una pipetta rifinita in plastica per trasferire le fette su un disco di carta da filtro che si trova in ACSF carbogenato a 25 °C per almeno 30 minuti prima della registrazione.
4. Strumenti
- Utilizzare una configurazione elettrofisiologica standard per eseguire la tecnica del patch clamp a cellula intera.
- Preparare le micropipette utilizzando un protocollo in due fasi (fase di riscaldamento 1: 70; fase di riscaldamento 2: 45) su un estrattore per micropipette (vedere la Tabella dei materiali).
- Quando vengono inserite nella vasca da bagno, le micropipette devono avere una resistenza finale compresa tra 3 e 5 MΩ con una soluzione interna.
nota: Le impostazioni utilizzate possono variare a seconda della temperatura all'interno della stanza e possono cambiare abbastanza frequentemente.
5. Elettrofisiologia del Patch Clamp a Cellula Intera
- Per ottenere registrazioni di patch clamp su cellule intere dai singoli neuroni nell'MVN, viene utilizzata una soluzione interna basata su K+ all'interno della pipetta di registrazione.
- Trasferire una singola fetta di tessuto dalla camera di incubazione alla camera di registrazione e fissarla utilizzando un filo di nylon su un peso a forma di U. Perfondere continuamente la camera di registrazione con ACSF carbogenato a 25 °C a una velocità di flusso di 3 mL/min.
- Dopo aver riempito una micropipetta con soluzione interna, localizzare l'MVN utilizzando una lente dell'obiettivo a bassa potenza (10x). Utilizzando un obiettivo ad alta potenza (40x), è possibile localizzare i singoli neuroni all'interno dell'MVN.
nota: La qualità della cella è essenziale per garantire registrazioni di qualità e durata della cella quando si tenta di ottenere la configurazione dell'intera cella. Una cellula adatta dimostrerà una forma sferica, una membrana cellulare riflettente e un nucleo invisibile. Una cellula inadatta avrà un nucleo grande e visibile (simile a un uovo) e un aspetto gonfio/rimpicciolito.
- Prima di rompere il fazzoletto con la pipetta, applicare una piccola quantità di pressione positiva per allontanare i detriti dal puntale della pipetta.
- Spostando la pipetta utilizzando il micromanipolatore verso il neurone scelto, si dovrebbe formare una piccola fossetta sulla membrana neuronale.
Rilasciare la pressione positiva e applicare una piccola quantità di pressione negativa.
- Una volta ottenuta una tenuta di 1 GΩ, applicare una pressione negativa delicata, breve e decisa sul supporto della pipetta attraverso la porta di aspirazione per rompere la membrana e creare una configurazione a cella intera.
- Effettua registrazioni con pinza di corrente a cella intera utilizzando tecniche standard.
6. Applicazione del rumore sinusoidale e stocastico ai singoli neuroni del nucleo vestibolare mediale
- Applicare il rumore stocastico e sinusoidale a una gamma di ampiezze da 3 a 24 pA per determinare la soglia neuronale e la velocità di attivazione.
- Determinare la soglia sensoriale raggruppando le intensità di stimolo più basse e più alte ed eseguire un'ANOVA per osservare eventuali differenze (come mostrato nella Figura 1).
- Calcolare la velocità media di sparo nel periodo di 10 s in cui il passo di corrente depolarizzante è stato/sarà iniettato per ogni singolo livello di corrente (ad esempio, 7 episodi totali; Figura 2).
- Utilizzare i valori medi della velocità di attivazione per generare una velocità di attivazione rispetto al grafico corrente ed eseguire un'analisi di regressione lineare per determinare il gradiente della linea di adattamento. Il gradiente della linea più adatta indica il guadagno neuronale.
