Rilevamento dei livelli di perossido di idrogeno nei neuroni in coltura attraverso l'imaging a fluorescenza su cellule vive

Abstract

Fonte: Terzi, A. et al., ROS Imaging di cellule vive durante lo sviluppo neuronale.J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra una tecnica per rilevare i livelli di perossido di idrogeno in tempo reale nelle cellule gangliari retiniche utilizzando il biosensore roGFP2-Orp1 e tecniche di imaging di cellule vive. Delinea le fasi coinvolte nella preparazione delle cellule, nell'imaging a fluorescenza e nella quantificazione dei livelli di perossido di idrogeno.

Protocollo

1. Imaging in vitro di specie reattive dell'ossigeno (ROS) di neuroni di cellule gangliari retiniche (RGC) in coltura

1. Il giorno dell'imaging (in genere 6-24 ore dopo la placcatura cellulare), controllare le cellule gangliari retiniche al microscopio per convalidare la crescita degli assoni RGC.
2. Per l'imaging di cellule vive, trasferire i vetrini coprioggetti dalla piastra di coltura a una camera di imaging di cellule vive.
3. Impostare il microscopio per l'imaging. Utilizzare un microscopio invertito dotato di un obiettivo a contrasto interferenziale differenziale (DIC), filtro rosso passa-lungo OG590 e una telecamera EM-CCD.
4. Prima dell'imaging, sostituire il terreno di coltura cellulare di zebrafish con siero e antibiotici (ZFCM)(+)) con un terreno di coltura cellulare di zebrafish senza siero e antibiotici (ZFCM(-)).
5. Una volta posizionate le celle con l'obiettivo 10x, acquisire immagini con ingrandimento 60x utilizzando un obiettivo a immersione in olio ad alta NA. Utilizzare un ingrandimento aggiuntivo di 1,5x.
6. Innanzitutto, acquisisci le immagini DIC. Quindi, creare un'immagine roGFP2-Orp1 utilizzando un set di filtri appropriato. Eccita roGFP2-Orp1 con filtri di eccitazione 405/20 e 480/30 nm in sequenza e acquisisci immagini con filtro di emissione 535/30 nm dopo che la luce di emissione ha superato lo specchio dicroico 505DCXR.
7. Dopo aver scattato la prima serie di immagini, scambiare i terreni con i supporti contenenti diverse soluzioni di trattamento. Il terreno deve essere cambiato ogni 30 minuti di imaging per evitare variazioni di pH e osmolarità.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piatto di coltura da 35 mm	Sarstedt	83-3900
Vetro di copertura	Corning	2850-22
Piastre di Petri monouso (100 x 15 mm)	VWR	Codice 25384-094
Siero fetale bovino	ThermoFisher Scientifico	26140087
Microscopio invertito	Nikon	TE2000
Laminina	ThermoFisher Scientifico	Codice 23017-015
L-15 Medium di Leibovitz con rosso fenolo	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
L-15 Medium di Leibovitz senza rosso fenolo	Gibco/Fisher Scientific	Codice 21-083-027
Penicillina/streptomicina	ThermoFisher Scientifico	15140122
Rosso fenolo	Sigma Aldich	P0290
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma Aldich	P7280
Filtro Steritop da 0,22 μm	Millipore	S2GPT05RE
Cloruro di calcio diidrato	Fisher Scientifico	C79-500
glucosio	Sigma Aldrich	G7528
HEPES	Sigma Aldrich	H4034