Stabilire una configurazione a cellula intera per l'imaging del calcio a due fotoni di fette di cervello

Abstract

Fonte: Camiré, O., et al. Imaging del calcio a due fotoni nei dendriti neuronali nelle fette di cervello. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra un protocollo per la registrazione di patch-clamp su cellule intere e l'imaging del calcio a due fotoni in fette di ippocampo cerebrale. Questo metodo permette di studiare la dinamica dei transienti locali di Ca²⁺ (CaT) in dendriti di diversi tipi neuronali in fette cerebrali acute.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dall'appropriata revisione etica degli animali.

1. Preparazione preliminare (opzionale: preparare con 1 giorno di anticipo)

1. Preparare tre tipi di soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (soluzione normale, saccarosio e soluzione di recupero, 1 litro ciascuna; vedere Tabella 1). Regolare l'osmolalità delle soluzioni a 300 ± 10 mOsm e raffreddare l'ACSF-saccarosio fino a un punto vicino al congelamento (0-4 °C).
   nota: L'uso di una soluzione di taglio a basso contenuto di sodio (ACSF-saccar....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ceppo animale: Topo CD1	Fiume Carlo	22
cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C4901
D-(+)-glucosio	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	Codice: M8266
Solfato di magnesio eptaidrato	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldeide in polvere, 95%	Sigma-Aldrich	158127
cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P3911
Gluconato di potassio	Sigma-Aldrich	P1847
Aziduro di sodio	Sigma-Aldrich	Episodio 2002
bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S8875
cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S5886
saccarosio	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Base Trizma	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma cloridrato	Sigma-Aldrich	T3253
Sodio fosfato bibasico diidrato	Sigma-Aldrich	Codice 71643
Sodio fosfato monobasico Monoidrato	Sigma-Aldrich	S9638
Biocitina	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Idrazide	ThermoFisher Scientifico	Codice: A10438
SR95531 (Gabazina)	Abcam	ab120042
Adenosina trifosfato (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	Codice: A9062
Guanosina (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Verde Oregon BAPTA-1	ThermoFisher Scientifico	O6812
Fosfocreatina di(tris) sale	Sigma-Aldrich	P1937
Alexa-546 coniugato con streptavidina	ThermoFisher Scientifico	S11225
Capillari in vetro borosilicato patch	Strumenti di precisione mondiali	1B100F-4
Capillari in vetro borosilicato Theta	Strumento Sutter	BT-150-10
P-97 Estrattore per micropipette fiammato/marrone	Strumento Sutter
Microscopio multifotone confocale TCS SP5	Leica Microsystems
Laser multifotone Chameleon Ultra II Ti:Zaffiro	coerente
Software di acquisizione immagini LAS AF	Leica Microsystems
Regolatore di temperatura TC-324B	Strumenti Warner
Amplificatore MultiClamp 700B	Dispositivi molecolari
Digitalizzatore Digidata 1440A	Dispositivi molecolari
Traduttore confocale	Siskiyou
Micromanipolatore	Siskiyou
Software di acquisizione dati pClamp	Dispositivi molecolari
A365 Isolatore di stimolo a corrente costante	Strumenti di precisione mondiali
Tavolo ottico Vibraplane	Sistemi cinetici