Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dall'appropriata revisione etica degli animali.
1. Preparazione preliminare (opzionale: preparare con 1 giorno di anticipo)
- Preparare tre tipi di soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (soluzione normale, saccarosio e soluzione di recupero, 1 litro ciascuna; vedere Tabella 1). Regolare l'osmolalità delle soluzioni a 300 ± 10 mOsm e raffreddare l'ACSF-saccarosio fino a un punto vicino al congelamento (0-4 °C).
nota: L'uso di una soluzione di taglio a basso contenuto di sodio (ACSF-saccarosio) aiuta a preservare la vitalità dei neuroni negli strati superficiali delle fette acute.
- Preparare 0,75 ml di soluzione cerotto contenente un fluoroforo rosso (ad es. Alexa-594) e un indicatore di calcio sintetico verde (ad es. Oregon Green BAPTA-1; vedere Tabella 1). Includere la biocitina (vedere Tabella 1) nella soluzione di cerotto se è richiesta l'identificazione morfologica post hoc delle cellule registrate.
- Regolare l'osmolalità della soluzione a 280 ± 5 mOsm e il pH a 7,35 ± 0,5. Conservare la soluzione in frigorifero o con ghiaccio in ogni momento.
nota: La scelta dell'indicatore del calcio dovrebbe essere basata sul suo intervallo dinamico e sulla natura degli eventi di Ca2+ studiati.
- Utilizzando un estrattore per micropipette, preparare pipette patch da capillari in vetro borosilicato (vedere Tabella dei materiali) con una punta da ≈ 2 μm (resistenza della pipetta di 3-5 MΩ) e pipette di stimolazione da capillari in vetro teta borosilicato (vedere Tabella dei materiali) con una punta da 2-5 μm.
nota: Le impostazioni dell'estrattore per realizzare pipette di un determinato diametro e forma saranno determinate dal tipo di filamento dell'estrattore e dai risultati del test di rampa per un determinato tipo di vetro.
2. Registrazioni Patch-clamp a celle intere
- Posizionare una fetta di ippocampo in una vasca da bagno posizionata sotto l'obiettivo (ingrandimento: 40x, apertura numerica: 0,8) di un microscopio a scansione laser a due fotoni. Perfondere continuamente il bagno con ACSF-Normal ossigenato riscaldato a 30-32 °C a una velocità di 2,5-3 mL/min.
- Utilizzare il contrasto di interferenza differenziale a infrarossi (IR-DIC) o la microscopia Dodt-SGC per localizzare una cellula di interesse utilizzandone le dimensioni, la forma e la posizione.
nota: A seconda della popolazione neuronale mirata, un modello murino transgenico può essere utilizzato per localizzare facilmente le cellule di interesse. In questo caso, questo passaggio può essere sostituito con l'utilizzo di una sorgente luminosa fluorescente.
- Riempire una pipetta di stimolazione con una soluzione ACSF-Normal contenente il fluoroforo rosso (ad es. Alexa-594).
- Posizionare la pipetta di stimolazione (collegata a un'unità di stimolazione elettrica) sopra la fetta in modo che la punta si trovi nella stessa regione della cellula di interesse.
- Dopo aver riempito la pipetta per cerotti con la soluzione per cerotti e averla fissata a uno stadio per la testa, posizionarla sopra la fetta in modo che la sua punta si trovi direttamente sopra la cellula di interesse.
- Inserire una siringa in un rubinetto a tre vie e collegarla alla pipetta per cerotti attraverso il tubo di plastica. Iniettare una pressione positiva costante nella pipetta per cerotti (≈ 0,1 ml) utilizzando la siringa. Mantenere il rubinetto in posizione "chiusa".
- Attivare il modulo software di controllo dell'amplificatore e passare alla modalità voltage-clamp facendo clic sul pulsante "VC". Aprire il software di acquisizione dati elettrofisiologici (ad es. clampex) per l'acquisizione di segnali elettrofisiologici e fare clic sull'icona "Test membrana" per inviare continuamente un impulso di tensione quadrata (5 mV, 10 ms), necessario per monitorare le variazioni della resistenza della pipetta.
- Abbassare la pipetta per cerotti fino a quando non si trova proprio sopra la cellula di destinazione. Al contatto con la membrana cellulare, rimuovere la pressione ruotando il rubinetto in posizione "aperto".
nota: Il contatto con la membrana cellulare viene rilevato quando si osserva un piccolo aumento della resistenza della pipetta (≈ 0,2 MΩ) e una piccola rientranza sulla cella è causata da una pressione positiva.
- Applicare una leggera pressione negativa sulla pipetta patch utilizzando una siringa vuota inserita nel rubinetto fino a quando la resistenza della pipetta fornita dal software raggiunge 1 GΩ. Nella finestra "Test della membrana" del software di acquisizione dati, bloccare la cella a -60 mV.
- Continuare ad applicare una pressione negativa fino all'apertura della cella e al raggiungimento della configurazione dell'intera cella. Il rilevamento di questo stato cellulare si basa sull'improvviso cambiamento della resistenza della pipetta (da 1 GΩ a 70-500 MΩ a seconda del tipo di interneurone) e sulla comparsa di grandi transitori capacitivi nella finestra "Test di membrana".
3. Imaging di calcio (Ca2+) a due fotoni
- Se interessati alle risposte postsinaptiche eccitatorie, aggiungere il bloccante del recettore GABAA gabazina (10 μM) e il bloccante del recettore GABAB CGP55845 (2 μM) al bagno ACSF.
- Nel modulo software di controllo dell'amplificatore, impostare la configurazione della patch su current-clamp facendo clic sul pulsante "CC" e registrare il modello di accensione della cella in risposta alle iniezioni somatiche di corrente depolarizzante (0,8-1,0 nA, 1 s). Attendere almeno 30 minuti affinché la cella si riempia con gli indicatori presenti nella soluzione di cerotto.
nota: Il modello di attivazione della cellula e le proprietà attive possono essere utilizzati per identificare il suo sottotipo, ad esempio le cellule a picco rapido. È importante che la concentrazione dell'indicatore si stabilizzi attraverso la diffusione prima di iniziare a registrare i transitori di calcio (CaT) (vedere la Tabella 2 per la risoluzione dei problemi).
- CaTs evocati da AP
- Utilizzando il software di acquisizione delle immagini, iniziare ad acquisire le immagini. Individua un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa. Per garantire una risposta visibile, in primo luogo, scegliere un dendrite prossimale (≤ 50 μm) poiché l'efficienza della retropropagazione dell'AP può diminuire significativamente con la distanza negli interneuroni GABAergici.
- Utilizzando lo "strumento rettangolare" nel software di acquisizione delle immagini, ingrandire la regione di destinazione e passare alla modalità "xt" (linesscan). Posizionare la scansione sul ramo dendritico di interesse. Con i controller di intensità laser nel software di acquisizione, impostare il laser a due fotoni a un livello di potenza minimo in cui la fluorescenza verde di base è appena visibile per evitare la fototossicità.
- Nella finestra "Protocollo" del software di acquisizione dati per elettrofisiologia, creare una prova di registrazione della durata desiderata contenente un'iniezione di corrente somatica dell'ampiezza desiderata.
- Utilizzando il software di acquisizione delle immagini, fare clic sul pulsante "Avvia registrazione" e acquisire la fluorescenza in modo continuo per 1-2 s. Ripetere l'acquisizione dell'immagine 3-10 volte. Attendere almeno 30 s tra le singole scansioni per evitare fotodanni. Se acquisisci linescan in più punti lungo un dendrite, prendili in ordine casuale per evitare effetti di ordine.
- CaTs evocati sinapticamente
- Individua un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa.
- Posizionare la pipetta di stimolazione sulla superficie della fetta sopra il dendrite di interesse. Abbassare lentamente la pipetta di stimolazione in posizione, riducendo al minimo i movimenti per evitare di disturbare la configurazione dell'intera cellula. Posizionare la pipetta a 10-15 μm dal dendrite.
- Per visualizzare la posizione dei microdomini sinaptici nei dendriti aspinosi, nel software di acquisizione delle immagini, passare alla modalità 'xt' (linescan) e posizionare la linea lungo il ramo dendritico di interesse.
- Nella finestra "Protocollo" (del software di acquisizione dati di elettrofisiologia) e nel software di acquisizione delle immagini, creare una prova di registrazione che attivi l'unità di stimolazione dopo l'inizio della prova.
- Utilizzando il software di acquisizione, fare clic sul pulsante "Avvia registrazione" per eseguire la scansione lungo il dendrite continuamente per 1-2 s. Ripetere l'acquisizione 3-5 volte, attendendo 30 s tra le scansioni per evitare fotodanni.
nota: La lunghezza della scansione può essere regolata in base alla cinetica dell'evento evocato, ma deve essere ridotta al minimo per evitare fotodanni (vedere la Tabella 2 per la risoluzione dei problemi).
- Ripetere il passaggio 3.4.5 in condizioni diverse (ad esempio, diversa intensità/durata della stimolazione, introduzione di un bloccante farmacologico, ecc.) a seconda della domanda specifica da affrontare.
- Interrompere l'acquisizione quando la cellula mostra segni di deterioramento della salute: depolarizzazione inferiore a -45 mV, aumento del livello basale di Ca2+, deterioramento morfologico dei dendriti (ad esempio, blebbing, frammentazione; vedere la Tabella 2 per la risoluzione dei problemi).
- Per ottenere informazioni preliminari sulla morfologia della cellula e tenere traccia della posizione della pipetta di stimolazione, acquisire una pila Z della cellula nel canale rosso. Utilizzando il software di acquisizione in modalità 'xyz', impostare i limiti superiore e inferiore dello stack per visualizzare l'intera cella con tutti i processi inclusi. Impostare la "dimensione del passo" a 1 μm e avviare l'acquisizione dello stack utilizzando il pulsante "Avvia registrazione".
- Al termine dell'acquisizione dello stack Z, utilizzare l'opzione "Proiezione massima" nel software per sovrapporre tutti i piani focali dello stack e verificare la qualità dell'acquisizione. Quindi, ritrarre lentamente la pipetta del cerotto dalla fetta.
- Per fissare la fetta per l'identificazione morfologica post hoc, rimuovere rapidamente la fetta dal bagno utilizzando un pennello piatto e posizionarla tra due carte da filtro in una capsula di Petri riempita di ACSF. Sostituire l'ACSF con una soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) e lasciare la capsula in una stanza a 4 °C o in frigorifero per una notte.
Tabella 1: Ricette per soluzioni. Composti e concentrazioni per le soluzioni utilizzate durante il protocollo.
| soluzione | componente | Concentrazione (mM) |
| ACSF-Normale | NaCl | 124 |
| Kcl | 2.5 |
| NaH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | numero arabo |
| NaHCO3 | 26 |
| glucosio | 10 |
| CaCl2 | numero arabo |
| ACSF-Recupero | NaCl | 124 |
| Kcl | 2.5 |
| NaH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 3 |
| NaHCO3 | 26 |
| glucosio | 10 |
| CaCl2 | 1 |
| ACSF-Saccarosio | Kcl | numero arabo |
| NaH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 7 |
| NaHCO3 | 26 |
| glucosio | 10 |
| saccarosio | 219 |
| CaCl2 | 1 |
| K+ | K+-gluconato | 130 |
| HEPES | 10 |
| MgCl2 | numero arabo |
| Fosfocreatina di(tris)sale | 10 |
| ATP-Tris | numero arabo |
| GTP-Tris | 0,2 |
| Biocitina | 72 |
| Alexa-594 | 0,02 |
| Oregon Verde-BAPTA-1 | 0,2 |
Tabella 2: Tabella di risoluzione dei problemi. Soluzioni a problemi comuni che possono sorgere durante un esperimento di imaging al Ca2+.
| problema | soluzione |
| Impossibile applicare il patch al neurone sano | Controlla i segni che le fette non sono salutari: cellule rimpicciolite o gonfie, nuclei visibili, ecc. In tal caso, scartare le fette. Verificare inoltre la resistenza della pipetta patch e l'osmolalità della soluzione patch; Sostituirli se i valori non sono compresi nell'intervallo appropriato. |
| Il segnale di fluorescenza dei dendriti è basso | Attendi più a lungo che la cella si riempia. Se un'ostruzione impedisce alla soluzione di cerotto di diffondersi nella cellula, provare ad applicare una piccola quantità di pressione negativa nella pipetta per cerotto. |
| La stimolazione elettrica non evoca una risposta al Ca2+ | Verificare la presenza di un artefatto nella registrazione elettrofisiologica. In caso di assenza, verificare la presenza di un malfunzionamento dell'unità in cortocircuito/stimolazione. Se presente, aumentare l'intensità della stimolazione o avvicinare la pipetta di stimolazione al dendrite. Va notato che la distanza tra l'elettrodo di stimolazione e il dendrite non deve superare gli 8 um per prevenire la depolarizzazione diretta dei dendriti quando si studiano le risposte sinaptiche. |
| Il segnale Ca2+ evocato è troppo alto/satura l'indicatore Ca2+ | Ridurre la potenza del laser. Se il problema persiste in più celle, utilizzare un indicatore Ca2+ diverso con un'affinità Ca2+ inferiore. |
| Il segnale Ca2+ di base aumenta gradualmente durante l'esperimento | Attendere un periodo più lungo tra le singole scansioni. Se la linea di base è ancora in aumento, interrompere l'acquisizione; Indica che la salute della cellula è probabilmente in declino. |
| L'ampiezza del segnale Ca2+ diminuisce durante le scansioni | Ridurre la potenza del laser o rimpicciolire (se applicabile). |
| I dendriti si frammentano ("blebbing") dopo la scansione | Ridurre la potenza del laser o rimpicciolire. Se il blebbing è limitato al dendrite mirato, scegli un altro dendrite e riduci la potenza del laser/zoom indietro. Se più dendriti sanguinano, interrompere l'acquisizione. |
| I segnali di fluorescenza "si spostano" fuori dalla linea di scansione dopo le scansioni | Riduci il movimento nella fetta riducendo la velocità di perfusione ACSF. Prima di applicare il rattoppo, assicurarsi che la fetta sia saldamente fissata in posizione da una rete. |