Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Assemblaggio della pipetta per iniezione di registrazione
- Estrarre un capillare di vetro lungo circa 7 cm (diametro esterno di 1 mm) utilizzando un estrattore per pipette.
- Rompere la punta del capillare e controllare l'apertura al microscopio ottico. Verificare che il diametro interno sia compreso tra 30 μm e 40 μm.
- Inserire un filo d'argento lungo 7 cm nel capillare di vetro, con circa 1 cm che sporge dall'estremità non affusolata della pipetta di vetro.
- Piegare il filamento in eccesso ortogonalmente al capillare di vetro.
- Applicare una goccia di adesivo plastico flessibile sullo stelo di un ago ipodermico da 30 G.
- Inserire un ago ipodermico da 30 G nella pipetta di vetro secondo gli schemi presentati nella Figura 1.
- Aggiungere un secondo strato di colla per garantire una corretta tenuta dalla giunzione tra la pipetta di vetro e l'ago ipodermico.
- Lasciare asciugare la pipetta con la punta rivolta verso l'alto per circa 12 ore per garantire una corretta polimerizzazione della colla. Il risultato finale è mostrato nella Figura 2.
NOTA: Questa procedura viene eseguita in esperimenti acuti e non è richiesta la sterilizzazione del puntale della pipetta.
2. Preparazione degli animali
- Metti il topo in una scatola per anestesia.
- Indurre l'anestesia utilizzando isoflurano al 4% per 5-10 minuti.
- Posizionare l'animale su un tavolo stereotassico con un termoforo e una sonda rettale per mantenere una temperatura corporea di 37 °C. Utilizzare un cono nasale con isoflurano al 2% per mantenere l'anestesia. Fissa la testa del topo usando le barre auricolari e un supporto per i denti.
- Applicare un unguento oftalmico o un collirio, comprese le gocce di atropina all'1%, per favorire la dilatazione della pupilla. Per prevenire la secchezza, applicare gocce lubrificanti ogni 30 minuti circa.
- Radere la testa e pulirla con il 10% di iodio povidone.
- Per l'anestesia locale, iniettare 0,5 ml di lidocaina al 2% sotto il cuoio capelluto in 2-3 punti sollevando la pelle e inserendo la punta dell'ago.
- Confermare un livello adeguato di anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi e osservando la mancanza di movimento. Inoltre, la frequenza cardiaca deve essere monitorata per assicurarsi che rientri nei valori normali (da 300 a 400 battiti/min).
- Incidere il cuoio capelluto in linea retta lungo la mediana con una lama di bisturi #10 per esporre sia le suture coronali che sagittali.
- Rivela i punti Lambda e Bregma spingendo da parte il tessuto che copre il cranio con una spatola chirurgica.
- Livellare il cranio in modo che le posizioni Bregma e Lambda siano sullo stesso piano.
- Per impostare il punto di riferimento, utilizzare un dispositivo stereotassico con un tubo di vetro montato per posizionarlo proprio sopra Bregma. Questo sarà lo "zero" per le coordinate di misurazione anteroposteriore e mediale-laterale.
- Imposta il punto di interesse spostando la montatura stereotassica alle coordinate richieste, annota le coordinate stereotassiche e disegna un quadrato attorno all'area di destinazione che segna il punto in cui verrà eseguita la craniotomia.
- Utilizzare un trapano chirurgico con un trapano sterilizzato lungo il quadrato contrassegnato lentamente senza pressione per rimuovere il materiale osseo. Fai attenzione a non perforare troppo a lungo nella stessa area, poiché produrrà calore e causerà lesioni sulla corteccia.
- Quando l'osso che delimita la craniotomia è diventato sufficientemente sottile, rimuovere con cura la sezione cranica con una pinzetta per esporre la corteccia.
- Irrigare frequentemente la corteccia esposta con liquido cerebrospinale artificiale per prevenire l'essiccazione dei tessuti.
nota: La rimozione della dura madre non è necessaria sul ratto poiché la punta dell'iniettore è abbastanza robusta da penetrare.
3. Riempimento e montaggio del sistema di iniezione
- Riempire la microsiringa da 5-10 μl mediante aspirazione con olio minerale.
- Riempire l'ago ipodermico con la pipetta di vetro fissa con una soluzione di Chicago Sky Blue (CSB) allo 0,5% e acido γ-aminobutirrico (GABA) 300 μM o una soluzione di lidocaina al 2% con CSB 9 allo 0,5%. Diluire tutte le soluzioni con soluzione fisiologica.
- In caso di sostanza abbondante, riempire con una siringa normale e utilizzare le consuete tecniche preventive per evitare la formazione di bolle d'aria.
- Nel caso di sostanze più costose, l'olio minerale può essere utilizzato per riempire l'iniettore e l'agente chimico può quindi essere introdotto per aspirazione. La differenza di densità tra l'olio minerale e l'acqua è relativamente alta, quindi questa sostanza è un buon candidato per l'iniezione di soluzioni acquose.
nota: È possibile aggiungere un colorante per confermare la separazione tra i due liquidi.
- Per riempire la pipetta per iniezione, aspirare una siringa da 1 ml con la soluzione e iniettarla lentamente nella pipetta.
- Prestare particolare attenzione alle perdite nelle regioni indicate nella Figura 1 tamponando queste aree e osservando le perdite iniettando lentamente la soluzione con la siringa.
- Rimuovere la siringa da 1 ml. Nel fare ciò, mantenere una leggera pressione sullo stantuffo in modo che il vuoto non rimuova la soluzione dalla pipetta per iniezione.
- Aspirare la microsiringa con olio minerale e fissarla saldamente alla pipetta per iniezione riempita. Quindi, rimuovere accuratamente la soluzione in eccesso dall'iniettore assemblato con una garza.
- Iniettare un volume molto piccolo, sufficiente per vedere una piccola goccia formarsi sulla punta della pipetta di vetro, per verificare che la punta non sia ostruita.
- Montare l'iniettore sul sistema di micropompa e assicurarsi che sia ben fissato.
- Posizionare con cautela la punta dell'iniettore alle coordinate target e abbassare la punta sulla superficie della corteccia.
- Abbassare lentamente l'inietto, utilizzando l'apparato stereotassico, fino alla struttura bersaglio (collicolo superiore), utilizzando le coordinate anatomiche appropriate.
- Copri la corteccia esposta con agar caldo per prevenire l'essiccazione dei tessuti.
4. Iniezione e inattivazione reversibile
- Impostare la pompa di microiniezione per iniettare da 400 a 800 nl a 40 nl/min e premere Esegui per avviare l'iniezione. Si noti che il tasso di picco mostrerà una riduzione durante l'iniezione.
NOTA: Nella configurazione sperimentale, l'attività neurale si è ripresa entro un'ora dalla fine della somministrazione di GABA. Qualsiasi dispositivo meccanico calibrato può essere utilizzato per applicare pressione alla siringa per microiniezione ed eseguire l'iniezione.
- Dopo aver acquisito i dati elettrofisiologici, eseguire l'eutanasia utilizzando un metodo approvato dalla Comunità Etica Animale locale.
