Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione delle Soluzioni
- Preparare 500 ml di liquido cerebrospinale artificiale standard (ACSF) contenente i componenti descritti nel nostro lavoro pubblicato come elencato nella Tabella 1.
- Utilizzare becher di vetro puliti con acqua deionizzata per preparare una soluzione ACSF fresca. Pulire le spatole con acqua deionizzata e asciugarle prima dell'uso per aggiungere cloruro di sodio (NaCl), cloruro di potassio (KCl), fosfato di sodio bi-idrogeno (NaH2PO4), bicarbonato di sodio (NaHCO3), solfato di magnesio (MgSO4), D-glucosio, e aggiungere il cloruro di calcio (CaCl2) dopo aver fatto bollire la soluzione con 95% O2 / 5% CO2miscela per ~20 minuti (come dettagliato nella Tabella 1) a 500 ml di acqua deionizzata. Mescolare fino a completo scioglimento.
- Assicurarsi che l'ACSF sia completamente limpido senza precipitazioni. Quindi, regolare il pH a 7,2-7,4. Bolla con una miscela di gas composta da 95% O2 e 5% CO2 per ~20 min.
- Preparare 250 ml di soluzione per tagliare le fette contenente le sostanze chimiche descritte nella Tabella 2.
- Aggiungere KCl, cloruro di magnesio (MgCl2), NaH2PO4, NaHCO3, colina·Cl e D-glucosio e aggiungere il cloruro di calcio (CaCl2) per ultimo come indicato al punto 1.1.1, a 250 mL di acqua deionizzata e sciogliere come descritto nei punti 1.1.1 e 1.1.2.
- Dopo aver fatto bollire con il 95% di O2/5% di CO2, mettere la soluzione in congelatore per 15-20 minuti in modo che la soluzione di taglio diventi ghiacciata e parzialmente congelata.
nota: Usiamo questa soluzione di taglio quando prepariamo fette da topi di 1-2 mesi; La formula può differire per i topi di età superiore ai 2 mesi.
- Preparare una soluzione di lipopolisaccaride (LPS) sciogliendola in soluzione salina isotonica sterile priva di endotossine (NaCl allo 0,9%). L'LPS viene somministrato per via intraperitoneale (0,5 mg/kg) e inizia la registrazione 2 ore dopo.
2. Preparazione della fetta di corteccia prefrontale
- Togliete la soluzione di taglio dal congelatore e omogeneizzatela fino ad ottenere una granita. Mettere la soluzione sul ghiaccio e far bollire costantemente con il 95% di O2/5% di CO2.
- Usando forbici grandi e affilate, decapitare rapidamente un topo come descritto e mettere immediatamente la testa in un bicchiere riempito con soluzione di taglio ghiacciata (0-4°C).
- Taglia la parte superiore del cranio lungo la linea mediana in direzione caudale-nasale con forbici sottili e rimuovi le porzioni laterali del cranio. Rimuovere il cervello con una spatola fine e immergerlo in una soluzione di taglio ghiacciata.
nota: I passaggi 2.2-2.3 devono essere eseguiti rapidamente (idealmente < 1 minuto).
- Posizionare il cervello sul coperchio di una capsula di Petri di 9 cm riempita di ghiaccio. Sciacquare il cervello con una soluzione da taglio ghiacciata. Taglia il cervelletto e il bulbo olfattivo con una lama di rasoio.
- Applicare la colla cianoacrilica sul portacampioni di un vibratomo. Posizionare con cura il blocco cerebrale sulla goccia di colla, con il lato rostrale rivolto verso l'alto, e immergerlo immediatamente in una soluzione di taglio ghiacciata.
- Regolare il portalama del vibratomo a un angolo di 15° rispetto al piano orizzontale e preparare fette di cervello coronale da 350 μm (frequenza di vibrazione della lama = 85 Hz, velocità = 0,1 mm/s).
- Utilizzando una pipetta, trasferire le fette nella camera di recupero riempita con ACSF, incubare per 1 ora (a RT) con gorgogliamento costante di 95% O2/5% CO2.
3. Registrazione delle patch a cella intera
- Realizzare micropipette in borosilicato di vetro da utilizzare come elettrodi di registrazione o micropipette a sbuffo secondo le linee guida specifiche nel Manuale d'uso dell'estrattore. Per la registrazione degli elettrodi, le resistenze dei puntali sono comprese tra 4 e 6 MΩ, mentre le micropipette a soffio hanno diametri dei puntali compresi tra 2 e 5 μm.
- Aggiungere il bloccante del canale Na+ (Tetrodotossina (TTX), 1 μM), per bloccare il canale Na+ veloce e quindi i potenziali d'azione, all'ACSF e mantenere una portata costante di questa soluzione di 2-3 mL/min nella camera di registrazione, mediante pompa peristaltica nella camera e aspirazione fuori da essa. Bollare costantemente l'ACSF con il 95% di O2/5% di CO2 per garantire la vitalità delle fette.
- Trasferire una fetta di cervello nella camera di registrazione utilizzando una pipetta Pasteur modificata la cui punta sottile è stata tagliata per adattarsi alle dimensioni della fetta. Coprire la fetta con un'ancora per fette di platino con fili di nylon paralleli distanziati di ≥2 mm l'uno dall'altro per tenere la fetta sulla piattaforma.
- Riempire la micropipetta di registrazione con la soluzione interna (Tabella 3) e riempire le micropipette a sbuffo con acido gamma-aminobutirrico (GABA) a 10 μM, 50 μM e 100 μM (disciolto in ACSF) o ACSF come controllo del veicolo.
- Per evitare l'ostruzione con detriti, applicare una leggera pressione positiva utilizzando una siringa da 1 ml prima di immergere l'elettrodo di registrazione nell'ACSF. Utilizzando un micromanipolatore al microscopio (obiettivo 4x), posizionare l'elettrodo di registrazione e la micropipetta a sbuffo in modo che le punte appaiano al centro dell'immagine video nel monitor (Figura 1A).
- Regolare la messa a fuoco del microscopio (obiettivo 40x) abbassando gradualmente la micropipetta a sbuffo e posizionarla sopra il neurone di registrazione con un angolo di 45°. Mantenere la distanza tra la punta della micropipetta a sbuffo e il neurone registrato tra 20 e 40 μm (Figura 1B). Avvicinarsi lentamente e con attenzione al neurone con l'elettrodo di registrazione e quindi rilasciare la pressione positiva. Applicare un'aspirazione debole e breve attraverso il tubo collegato al portaelettrodo per creare una tenuta giga-ohm.
- Mantenere la tensione a 0 mV. Dopo la formazione della guarnizione giga-ohm, compensare la capacità veloce e lenta manualmente o automaticamente. Quindi applicare una breve e forte aspirazione attraverso il tubo sopra menzionato per entrare in modalità cella intera.
- Registra eIPSC in modalità voltage-clamp. Applicare una bassa pressione del gas (azoto, 4 - 6 psi) alla micropipetta a sbuffo utilizzando un Picospritz controllato da un generatore di gradini di tensione Master 8 per erogare sbuffi GABA singoli o accoppiati (Figura 2).
Tabella 1. Registrazione ACSF.
| sostanza | g/mol | Concentrazione (mM) | Peso (g/L) |
| NaCl | 58.443 | 119 | Codice 6.9547 |
| Kcl | 74.551 | 2.5 | 0,1864 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1 | 0,1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26.2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0,1565 |
| D-glucosio | 198,17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110,98 | 2.5 | 0,2775 |
Tabella 2. Soluzione per il taglio delle fette.
| sostanza | g/mol | Concentrazione (mM) | Peso (g/L) |
| Kcl | 74.551 | 2.5 | 0,1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0,6665 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1.25 | 0,1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Colina·Cl | 139,63 | 115 | Codice 16.0575 |
| D-glucosio | 198,17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110,98 | 0,5 | 0,0555 |
Tabella 3. Soluzione interna per la registrazione di patch a celle intere.
| sostanza | g/mol | Concentrazione (mM) | Peso (g/L) |
| Cs gluconato | 328.052 | 100 | Codice 32.8052 |
| CsCl | 168,36 | 5 | 0,8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | numero arabo | 0,1904 |
| CaCl2 | 110,98 | 1 | 0,1110 |
| BAPTA | 476.433 | 11 | 5.2408 |
| Na2ATP | 551,1 | 4 | 2.2044 |
| Na2GTP | 523,2 | 0,4 | 0,2093 |
