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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Soluzioni esterne e interne
- Utilizzare la soluzione di Ringer per mammiferi durante la dissezione della retina e come soluzione esterna nella successiva registrazione elettrofisiologica. Preparare la soluzione di Ringer per mammiferi da 10 soluzioni madre (senza calcio) il giorno della registrazione e aggiungere CaCl2 goccia per goccia dopo 15 minuti di carbogenazione (95% O2 e 5% CO2). L'ultima soluzione 1x contiene (in mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na2HPO4, 0,1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 e 10 D-glucosio.
- Utilizzare due soluzioni interne per caratterizzare le oscillazioni SAC. Testare l'utilità delle soluzioni preparate in registrazioni prolungate di patch clamp su cellule gangliari retiniche di topo adulto (RGC) e conservare i lotti verificati in aliquote da 500 μl a -20 °C fino all'uso.
- Per registrare l'oscillazione del potenziale di membrana, utilizzare una soluzione interna a base di potassio che contenga (in mM): 125 K-gluconato, 8 NaCl, 4 adenosina trifosfato (ATP)-Mg, 0,5 Li-guanosina trifosfato (GTP), 5 acido etilenglicole tetraacetico (EGTA), 10 acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) e 0,2% di biocitina (p/v). Regolare il pH a 7,3 con KOH.
- Per la registrazione delle correnti postsinaptiche eccitatorie e inibitorie, utilizzare una soluzione interna a base di cesio che contenga (in mM): 100 Cs-metansolfonato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% di biocitina (p/v). Regolare il pH a 7,3 con CsOH.
2. Preparazione per il Giorno di Registrazione
- Per preparare una membrana in nitrocellulosa con fori aperti, perforare manualmente la membrana con un perforatore personalizzato ricavato da un ago da siringa smussato da 16 G e appiattire la membrana tra due lastre di vetro pulite. Per una retina a montaggio intero, praticare un foro centrale di 0,2 mm di diametro e circondarlo da 4 fori più grandi di 1-1,2 mm di diametro.
- Per creare un filamento di riempimento personalizzato per caricare la soluzione interna negli elettrodi, fondere un puntale per pipetta da 10 μl al centro e allungare delicatamente la parte fusa fino a quando non si raffredda e si indurisce. Poco prima dell'uso, utilizzare una lama di rasoio pulita per tagliare il filamento fino a quando non è leggermente più lungo delle pipette patch.
- Estrarre le pipette per cerotti in un estrattore programmabile da un tubo di vetro borosilicato con un filamento interno. Fabbricare le micropipette il giorno dell'esperimento e utilizzarle immediatamente.
nota: Per la registrazione dei SAC, utilizziamo la seguente impostazione dell'estrattore: calore: 484; tirare: 0; velocità: 25; tempo di ritardo: 1; Pressione: 400 e un valore di rampa di 462. Il diametro esterno (O.D.) e il diametro interno (I.D.) dei tubi in borosilicato sono rispettivamente di 1,65 mm e 1,0 mm. La resistenza delle pipette è di 10-14 MΩ.
- Un'ora prima del prelievo del tessuto, scongelare un tubo di soluzione interna agitandolo a vortice per >30 minuti.
3. Dissezione della retina
- Anestetizzare l'animale con il 4% di isoflurano in ossigeno fino a quando l'animale non perde la reattività a un pizzicamento del dito del piede. Sacrificare l'animale mediante lussazione cervicale.
- Tagliare entrambi i bulbi oculari dai nervi ottici a 1-2 mm di distanza dalle teste dei nervi ottici con forbici dell'iride a punta dritta.
- Arrotolare i bulbi oculari su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere il sangue e poi immergerli nella soluzione di mammifero carbogenato Ringer. Fai un buco nel limbus con un ago da 23 G e taglia in due i bulbi oculari tagliando lungo il limbus con le microforbici. Rimuovere la cornea e il cristallino utilizzando una pinza sottile.
- Per la retina a montaggio intero, staccare delicatamente l'intera retina dall'epitelio pigmentato con una pinza fine ed eseguire quattro tagli ortogonali da 1,5-2 mm dal bordo verso la testa del nervo ottico.
- Immergere una membrana di nitrocellulosa perforata nel piatto e trascinare delicatamente la retina su di essa con lo strato di cellule gangliari (GCL) rivolto verso l'alto. Posizionare la testa del nervo ottico nel foro centrale quando si prepara una retina a montaggio intero. Trasferisci la membrana con la retina in un altro piatto pulito. Appiattisci delicatamente la retina con un pennello sottile per assomigliare a una croce di Malta e stendi tutti e quattro i bordi sui fori.
- Se si deve esaminare una frazione della retina alla volta, tagliare ogni conchiglia oculare preparata dal passaggio 3.3 in 3-4 pezzi con una lama di rasoio con i resti dell'epitelio pigmentato attaccati. Proteggere i pezzi inutilizzati dalla luce in soluzione esterna carbogenata e utilizzarli entro 12 ore.
- Tamponare la membrana di nitrocellulosa con un pezzo di carta da filtro asciutta e rimuovere il vetroso e la membrana limitante interna con una pinza e un pennello.
- Assicurarsi che tutti i bordi retinici siano completamente attaccati alla membrana prima di trasferire il gruppo nella camera di registrazione con un vetrino di copertura sigillato sul fondo. Fissare la membrana con grasso sottovuoto al vetrino coprioggetti e reidratare la retina con la soluzione esterna. Fare attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto il gruppo.
- Posizionare la camera sul tavolino di un microscopio verticale. Perfondere la camera con una soluzione esterna carbogenata calda (34-35 °C) a una velocità di ~3 ml al minuto.
- Esamina prima la retina con una lente obiettivo 10x, quindi usa una lente a immersione in acqua 60x per vedere i neuroni GCL e dello strato nucleare interno (INL) sotto contrasto di interferenza differenziale (DIC) e/o epifluorescenza. Per visualizzare le SAC che esprimono tdTomato, utilizzare una sorgente luminosa a diodi emettitori di luce (LED) bianca in combinazione con un filtro di eccitazione da 554 nm e un filtro di emissione da 581 nm.
4. Registrazione Patch Clamp a cellula intera da Retina a montaggio piatto
- Filtrare la soluzione interna attraverso un filtro a siringa nel filamento di riempimento personalizzato.
- Inserire il filamento in una micropipetta appena aspirata ed erogare la soluzione interna vicino alla punta fino a quando la soluzione non copre il filo dell'elettrodo d'argento per >5 mm. Fissare la micropipetta su un portaelettrodo con un'asta di aspirazione, attraverso la quale è possibile regolare la pressione all'interno dell'elettrodo spingendo o tirando lo stantuffo di una siringa di plastica da 10 ml collegata a un tubo.
- Trovare la pipetta sotto l'obiettivo e portarla a ~100 μm sopra la retina. In modalità inseguitore di corrente (I = 0), utilizzare l'offset CC per azzerare il segnale di tensione CC permanente. Misurare la resistenza della pipetta in modalità pinza amperometrica (IClamp) iniettando correnti a onda quadra di ampiezza fissa attraverso la pipetta mentre si trova nella vasca e neutralizzare la differenza ruotando la manopola Raccess. Utilizzare la lettura sulla manopola Raccess per calcolare la resistenza della pipetta secondo la legge di Ohm.
- Portare lentamente l'elettrodo a ~10 μm sopra la retina. Applicare una pressione positiva all'elettrodo. Osservate il cambiamento del riflesso vicino alla punta della pipetta mentre si avvicina alla retina. Forzare rapidamente ma delicatamente la pipetta nel GCL e ridurre immediatamente la pressione positiva.
- Spostare la pipetta verso un neurone marcato. Evitare il contatto con altri neuroni, vasi sanguigni e piedi terminali delle cellule di Muller. Applicare una maggiore pressione positiva, se necessario, per evitare l'intasamento dell'elettrodo.
- Posizionare la punta della pipetta vicino alla linea mediana di un neurone marcato fino a quando non è visibile una fossetta. Rilasciare la pressione positiva e lasciare che la membrana plasmatica rimbalzi sulla punta della pipetta.
- Applicare correnti negative da 20 a 120 pA alla pipetta per favorire la formazione di una tenuta giga-ohm. Se necessario, aspirare delicatamente la membrana plasmatica nella pipetta. Attendere 5 minuti dopo la formazione del sigillo per rompere la membrana cellulare. Ciò consente di eliminare la soluzione interna versata mediante superfusione. Rompere la membrana con una leggera aspirazione.
- Dopo la rottura della membrana e in modalità current clamp, attivare il bilanciamento del ponte e regolarlo utilizzando la manopola Raccess.
nota: Per una cella piccola come il SAC, è necessaria solo una leggera regolazione, se presente. In alternativa, registrare le correnti postsinaptiche eccitatorie e inibitorie in modalità voltage clamp (VClamp) mantenendo la cella ai potenziali di inversione rispettivamente di cloruro (circa -75 mV) e glutammato (circa 0 mV). Se necessario, controllare e regolare la posizione della pipetta per adattarsi a occasionali derive della retina e/o del micromanipolatore.
- Per registrare il potenziale di membrana o il cambiamento di corrente prima, durante e dopo il trattamento farmacologico, preparare bloccanti sinaptici (ad es. cianquixalina [CNQX], (2R)-ammino-5-fosfonopentanoato [AP5], picrotossina, tubocurarina, ecc.) e modulatori di canali (ad es. flupirtina, dopamina, acido meclofenamico, ecc.) freschi il giorno dell'esperimento da ceppi congelati. Diluire i farmaci con la soluzione di Ringer carbogenata. Applicarli in modo batch attraverso la perfusione.
- Dopo la registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dal soma. Trasferire il gruppo dalla camera a un piatto pulito. Staccare e riattaccare la retina su un'altra membrana di nitrocellulosa appiattita senza fori per garantire la planarità della retina durante la fissazione.