Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Montaggio di fette di tessuto del midollo spinale su MEA
- Riscaldare il terreno nutritivo sterile nell'incubatore (37 °C, coperchio leggermente svitato per l'ossigenazione).
- Posizionare l'array multielettrodo o MEA con pinzette sterili con punte rivestite di gomma a temperatura ambiente (RT) nella capsula di Petri sotto uno stereomicroscopio con l'array di elettrodi a fuoco. Centrare una gocciolina da 6 μl di plasma di pollo sull'array di elettrodi pulito, privo di polvere e sterile. Usando una piccola spatola, far scorrere con cautela due sezioni del midollo spinale con i lati ventrali rivolti l'uno verso l'altro nella gocciolina di plasma. Non toccare gli elettrodi con la spatola.
- Aggiungere 8 μl di trombina attorno alla gocciolina di plasma di pollo. Utilizzando la punta della pipetta per trombina, mescolare accuratamente e distribuire la miscela di plasma di pollo/trombina attorno alle due fette. Ancora una volta, non toccare direttamente l'array di elettrodi fragili. Poco prima della coagulazione, aspirare il plasma di pollo/trombina in eccesso.
- Tappare la capsula di Petri per mantenere un'elevata umidità mentre il gruppo MEA/coltura rimane per circa 1 ora in una camera umidificata all'interno dell'incubatore a 37 °C.
- Aggiungere con cautela 10 μl di terreno nutritivo nella camera di coltura, tappare la capsula di Petri e rimetterla nell'incubatore per circa 30 minuti.
- Posizionare ogni gruppo MEA/coltura con punte sterili rivestite di gomma in un tubo a rullo, aggiungere 3 ml di terreno nutritivo e chiudere ermeticamente il coperchio. Posizionare il tubo del rullo nel tamburo del rullo, ruotando a 1 - 2 giri/min nell'incubatore in un'atmosfera contenente CO2 al 5% a 37 °C.
- Cambiare metà del mezzo nutritivo dopo 7 giorni in vitro (DIV) e successivamente 1 - 2 volte a settimana.
2. Lesioni meccaniche
- Estrarre il gruppo MEA/coltura con punte sterili rivestite di gomma dal tubo del rullo e posizionarlo in una capsula di Petri senza mezzo nutritivo sotto uno stereomicroscopio con il tessuto a fuoco. Verificare visivamente che le due sezioni siano fuse.
- Tenere fermo il gruppo MEA/coltura posizionando una pinzetta con punte rivestite di gomma sul MEA.
- Posizionare una lama di bisturi nella scanalatura del MEA vicino alle fette di tessuto. Tieni il bisturi piuttosto orizzontalmente.
- Sollevare il manico del bisturi ma lasciare che la lama del bisturi rimanga nella scanalatura del MEA in modo tale che la lama "rotoli" dalla base alla punta e quindi tagli il tessuto che copre la scanalatura.
- Severe, se necessario, eventuali connessioni tissutali residue con una punta dell'ago da 25 G. Lavorare solo nell'area all'interno della scanalatura e non toccare i bordi teneri.
- Riposizionare il gruppo MEA/coltura nel tubo del rullo. Fornire 3 ml di terreno nutritivo fresco alle colture e rimetterle nel tamburo a rulli dell'incubatrice.
3. Registrazioni elettrofisiologiche dell'attività spontanea
- Per studiare la rigenerazione funzionale tra le due fette di midollo spinale dopo il numero scelto di DIV, montare l'assemblaggio MEA/coltura in una camera di registrazione al microscopio e applicare circa 500 μl di soluzione extracellulare (vedi elenco dei materiali).
- Attendere 10 minuti prima della prima registrazione per consentire al sistema di stabilizzarsi.
- Registrare l'attività spontanea di base 2 volte per circa 10 minuti da ciascun elettrodo di rilevamento dell'attività del MEA a RT.
- Per garantire condizioni extracellulari stabili, sostituire la soluzione extracellulare dopo ogni sessione di registrazione.
- Per disinibire la rete, applicare una soluzione extracellulare contenente stricnina (1 μM) e gabazina (10 μM). Attendere almeno 2 minuti prima di iniziare la registrazione.
4. Analisi dei dati
NOTA: Per la rilevazione dei potenziali d'azione registrati extracellulare, utilizzare un rivelatore basato sulle deviazioni standard e un discriminatore successivo per ogni elettrodo.
- Visualizzare l'attività neuronale rilevata di ciascun elettrodo in un grafico raster secondo le procedure standard (Figura 1F).
- Determinare e visualizzare l'attività di rete totale per ogni slice riepilogando il numero di eventi nei canali appropriati all'interno di una finestra scorrevole di 10 msec, spostata di passi di 1 msec (Figura 1G).
- Rileva in ogni fetta singoli burst (cluster di attività che appaiono su diversi elettrodi). Pertanto, impostare una soglia minima di attività di picco nell'attività di rete totale corrispondente e definire l'inizio e la fine di ogni burst. Ad esempio, una soglia appropriata è il 25% dell'ampiezza media della frammentazione e un inizio della raffica può essere definito come il primo evento in una finestra temporale di almeno 5 msec e una fine della frammentazione come l'ultimo evento in una finestra temporale di almeno 25 msec.
- Per quantificare la rigenerazione funzionale, calcolare la percentuale di burst sincronizzati tra le due sezioni. A tale scopo, calcolare la latenza tra una frammentazione in una sezione e la frammentazione successiva nell'altra sezione.
nota: Una coppia burst è definita "sincronizzata" quando la latenza è inferiore alla lunghezza media del burst. Soprattutto nelle co-culture con molta attività, esiste la possibilità che entrambe le parti avviino casualmente un burst nella finestra di latenza scelta. Questo fatto deve essere preso in considerazione nella quantificazione della percentuale di raffiche sincronizzate.
