Eccitazione esterna di colture neuronali con pattern unidimensionali

In questo articolo

Abstract

Source:Stern, S., et al. Eccitazione esterna di neuroni utilizzando campi elettrici e magnetici in culture monodimensionali e bidimensionali. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra una tecnica per stimolare colture neuronali con pattern lineari con un campo elettrico uniforme e unidirezionale.

Protocollo

1. Imaging dell'attività spontanea o evocata in colture neuronali con coloranti fluorescenti.

Preparare una soluzione di 50 μg di colorante fluorescente sensibile al calcio (vedere Tabella dei materiali/reagenti) in 50 μl di DMSO (dimetilsolfossido).
Preparare una soluzione di registrazione extracellulare (EM) contenente (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glucosio, 45 saccarosio (pH 7,4).
Incubare la coltura neuronale in 2 mL EM con 8 μL della soluzione di colorante fluorescente sensibile al calcio per 1 ora. Proteggere dalla luce e ruotare delicatamente per garantire una diffusione omogenea del colorante alle cellule.
Sostituire la soluzione con EM fresco prima dell'imaging. L'imaging fluorescente è illustrato nella Figura 1.
Immagine in un microscopio a fluorescenza con filtri ottici per l'imaging a fluorescenza del calcio (picco di eccitazione a 488 nm, picco di emissione a 520 nm), utilizzando una fotocamera e un software in grado di quantificare l'intensità di qualsiasi regione di interesse (ROI) all'interno del campo visivo del microscopio.

2. Stimolazione elettrica delle colture

NOTA: La configurazione di base per la stimolazione elettrica è mostrata nella Figura 2. Un vetrino coprioggetti su cui è stata coltivata la coltura neuronale per circa 14 giorni viene posto in una capsula di Petri sotto un microscopio a fluorescenza. L'attività elettrica dei neuroni viene ripresa utilizzando coloranti sensibili al calcio, mentre una tensione viene applicata tramite due coppie di elettrodi da bagno posizionati all'esterno della coltura. Gli elettrodi sono azionati da un generatore di segnale la cui uscita è amplificata da un amplificatore a doppio canale. Il controllo della tensione per la stimolazione è preferito al controllo della corrente più standard, perché i vettori del campo elettrico sono determinati direttamente, consentendo così l'aggiunta e la combinazione di vettori semplici. Ciò richiede un attento controllo dell'uniformità del campo elettrico, che può essere eseguito su tutto il campione nel caso del controllo di tensione. Quando si utilizza il controllo della tensione, è necessario prestare attenzione per evitare loop di massa e verificare l'omogeneità del campo elettrico.

Per la stimolazione elettrica con un campo elettrico omogeneo, utilizzare una coppia di fili di elettrodi paralleli.
1. Utilizzare elettrodi in platino con uno spessore dell'ordine di 0,005'' (127 μm). Se utilizzato con i vetrini coprioggetti da 13 mm, assicurarsi che la distanza tra i due elettrodi sia di circa 11 mm e posizionare gli elettrodi 1 mm sopra la coltura.
  NOTA: Per realizzare il portaelettrodo (Figure 3A), utilizzare politetrafluoroetilene (PTFE). Praticare fori stretti attraverso il PTFE per inserire gli elettrodi. Il dispositivo deve essere più alto della soluzione extracellulare in modo che l'estremità superiore, dove sono esposti gli elettrodi, non entri mai in contatto con la soluzione. Per l'isolamento, utilizzare colla epossidica su qualsiasi parte dei cavi degli elettrodi che potrebbe essere esposta.
2. Utilizzare una forma di impulso quadrata con un ciclo di lavoro del 50%, senza componenti CC per evitare l'elettrolisi. Variare la durata dell'impulso tra 10 μs e 4 ms per ottenere una stimolazione efficace senza bruciare la coltura. Assicurarsi che l'ampiezza sia dell'ordine di ± 22 V (vedere la Figura 3). L'impulso quadrato può essere osservato su un oscilloscopio collegato in parallelo agli elettrodi.
  nota: Per una facile programmazione di qualsiasi forma d'onda desiderata, utilizzare un software di modifica delle forme d'onda commerciale (vedere Elenco dei materiali). Inserire graficamente la forma d'onda desiderata e inviarla al generatore di forme d'onda.
Per verificare l'omogeneità del campo, utilizzare un elettrodo a sonda. Utilizzare una griglia di almeno 1 mm x 1 mm per consentire lo spostamento della sonda nell'area tra gli elettrodi e misurare il potenziale elettrico.
1. Misurare il potenziale elettrico. Usa per calcolare il campo elettrico. Utilizzare uno degli elettrodi come elettrodo di riferimento. Misurare il campo elettrico con durate dell'impulso variabili tra 100 μs e 4 ms (vedere la Figura 3B per un esempio di durata dell'impulso di 100 μs) per verificare che il campo sia omogeneo all'interno dell'intervallo di durate di stimolazione.
  nota: Vedere la Figura 3D per un esempio di omogeneità del campo elettrico misurata quando la durata dell'impulso era di 1 ms.

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Risultati

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Figura 1: Esempio di tracce di transitori di calcio riprodotte durante i burst di rete sincroni. Un'immagine di neuroni che sono stati tinti prima dell'esperimento con un colorante di calcio. B. Tracce di intensità in funzione del tempo delle ROI in A con il colore della traccia che rappresenta il colore del bordo della ROI in A. Un grande aumento dell'intensità sincronizzato all'int...