Stimolazione di colture neuronali modellate mediante un campo magnetico

Abstract

Fonte: Stern, S., et al., Eccitazione esterna dei neuroni utilizzando campi elettrici e magnetici in culture monodimensionali e bidimensionali. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra un metodo per stimolare colture neuronali coltivate in un anello circolare modellato su un vetrino coprioggetti, utilizzando un campo magnetico variabile nel tempo.

Protocollo

1. Preparazione di vetrini coprioggetti per colture 1D.

1. Pulire i vetrini coprioggetti mediante immersione in una soluzione piranha di base composta da 75 mL di DDW, 25 mL di soluzione di ammoniaca al 25% e 25 mL di perossido di idrogeno al 30%. Posizionare la soluzione con i vetrini coprioggetti su una piastra riscaldante a ~ 50°C per 30 minuti, quindi asciugare i vetrini coprioggetti con azoto.
2. In primo luogo, i vetrini coprioggetti vengono rivestiti con un sottile film di cromo (99,999%) di 6 Å di spessore, seguito da uno strato di 30 Å di oro (99,999%), utilizzando la deposizione a vapore o a polverizzazione.
   1. Per ottenere una velocità di sputtering di 0,05 – 1 Å /s, utilizzare una macchina sputtering con 2 e-beam e un sistema di vuoto da 260 l/s con dimensioni target 2" e 4". Utilizzare una fase di rotazione che può andare da 0 a 100 colpi al minuto (RPM). Utilizzare una potenza di sputtering in corrente continua (CC) da 0 a 750 Watt.
   2. Per ottenere il plasma a una pressione di 10 mTorr nella camera, ruotare il dispositivo a 30 giri/min e utilizzare l'argon al 99,999%.
   3. Far funzionare l'alimentazione delle pistole sputtering a 40 W di potenza di sputtering CC per il cromo, portando a un tasso di copertura di ~ 0,12 Å/s e a 10 W di potenza di sputtering CC per l'oro, portando a ~ 0,28 Å/s.
3. Utilizzando gli ultrasuoni per 30 minuti, sciogliere 0,1 g di 1-ottadecanetiolo in 100 ml di etanolo ABS AR. Posizionare i vetrini coprioggetti rivestiti in Cr-Au in questa soluzione per 2 ore, quindi lavare con etanolo ABS AR e asciugare con azoto.
4. Preparare una soluzione di 100 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS) e 3,5 g di un copolimero a tre blocchi (vedere la Tabella dei materiali/Reagenti) agitando per 1 - 2 ore a 600 - 700 giri/min. Mettere i vetrini coprioggetti nella soluzione per 1 ora. Asciugare i vetrini coprioggetti con azoto.
5. Incidere meccanicamente il modello desiderato graffiando lo strato di bio-rifiuto. Fallo usando un plotter a penna, dove la penna è sostituita da un ago per incisione. Graffia il motivo attraverso gli strati di metallo per raggiungere il vetro sottostante. Controlla questo processo da un computer per ottenere un modello desiderato replicato. I modelli formati da questo processo sono illustrati nella Figura 1 e nella Figura 2.
6. Preparare uno strato biocompatibile di 100 mL DI D-PBS, 3,5 g di copolimero tri-block, 35,7 μL/mL di fibronectina e 29 μl/mL di laminina.
   1. Sterilizzare i vetrini coprioggetti alla luce ultravioletta per almeno 10 minuti. Incubare i vetrini nella soluzione biocompatibile preparata durante la notte.
      NOTA: Lo strato biocompatibile si formerà solo dove lo strato di biorigetto è stato inciso nel passaggio precedente.
   2. Il giorno successivo, lavare i vetrini coprioggetti due volte con P-DBS. Incubarli in PM durante la notte. I vetrini coprioggetti sono ora pronti per la placcatura cellulare.

2. Mantenimento delle colture neuronali.

1. Preparare il terreno di cambio (CM) composto da (per mL): 0,9 mL MEM+3G, 0,1 mL HI HS, 10 μL 5-fluoro-2′-deossiuridina (FUDR) con uridina 100x.
2. Preparare il terreno finale (FM) composto da (per mL): 0,9 mL MEM+3G e 0,1 mL HI HS.
3. Sostituire il PM con 1-1,5 mL di CM dopo 4 giorni in vitro (DIV). A 6 DIV, sostituire il 50% del CM con un CM nuovo. A DIV 8, cambiare il terreno a 1,5 mL FM, seguito da una variazione del 50% di FM ogni 2 giorni. Dopo circa una settimana emerge un'attività sincrona spontanea.

3. Imaging dell'attività spontanea o evocata in colture neuronali con coloranti fluorescenti.

1. Preparare una soluzione di 50 μg di colorante fluorescente sensibile al calcio (vedere Tabella dei materiali/Reagenti) in 50 μl di DMSO (dimetilsolfossido).
2. Preparare una soluzione di registrazione extracellulare (EM) contenente (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glucosio, 45 saccarosio (pH 7,4).
3. Incubare la coltura neuronale in 2 mL EM con 8 μL della soluzione di colorante fluorescente sensibile al calcio per 1 ora. Proteggere dalla luce e ruotare delicatamente per garantire una diffusione omogenea del colorante alle cellule.
4. Sostituire la soluzione con EM fresco prima dell'imaging. L'imaging fluorescente è dimostrato nella Figura 3.
5. Immagine in un microscopio a fluorescenza con filtri ottici per l'imaging a fluorescenza del calcio (picco di eccitazione a 488 nm, picco di emissione a 520 nm), utilizzando una fotocamera e un software in grado di quantificare l'intensità di qualsiasi regione di interesse (ROI) all'interno del campo visivo del microscopio.

4. Stimolazione Magnetica delle Colture

Nota: La configurazione di base per la stimolazione magnetica è mostrata nella Figura 1. In alto a destra è mostrato un microscopio a fluorescenza invertita che viene utilizzato per visualizzare coloranti sensibili al calcio nei neuroni. La bobina magnetica (cerchi blu) è posizionata a circa 5 mm concentricamente sopra una coltura ad anello neuronale (contorno blu). Una bobina di raccolta (cerchio rosso) sulla circonferenza della capsula di Petri monitora la tensione indotta dall'impulso magnetico. In alto a sinistra è mostrata la dinamica misurata della bobina dello stimolatore magnetico (MS) con un carico di tensione del condensatore di 5.000 kV, come integrato dalla bobina di ripresa. Il campo elettrico indotto (calcolato per un raggio dell'anello di 14 mm) è rappresentato in verde mentre il campo magnetico è rappresentato in blu. Sul fondo sono mostrate le immagini della coltura neuronale. In basso a sinistra c'è un'immagine in campo chiaro di un vetrino coprioggetti da 24 mm. Le aree bianche sono i neuroni. Il modello fotografato è costituito da colture ad anello concentriche con raggi diversi. In basso a destra c'è uno zoom su un breve segmento degli anelli, che mostra i singoli neuroni. Per una scala, la larghezza degli anelli è di circa 200 μm.

1. Far crescere i neuroni in un modello ad anello circolare (inciso come descritto in 1.5) per la stimolazione della coltura 1D. Utilizzare un colorante fluorescente sensibile al calcio per l'imaging del calcio (come descritto nella sezione 3) con una coltura 1D modellata su linee sottili (170 μm), lunghe (10 mm).
   1. Utilizzare una bobina magnetica circolare e posizionare una piastra di Petri a circa 5 mm sotto e concentrica con la bobina. Utilizzare una bobina personalizzata di circa 30 mm (diametro interno, diametro esterno 46 mm) con un'induttanza di L = 90 mH azionata da un MS fatto in casa o in commercio caricato con una tensione massima di 5 kV.
   2. Per stimolare magneticamente le colture neuronali, un'alta tensione e una corrente vengono scaricate attraverso una bobina conduttrice utilizzando un interruttore ad alta corrente-alta tensione. Lo stimolatore magnetico (MS) può essere costruito utilizzando condensatori di grandi dimensioni, dell'ordine di 100 mF, per ottenere un'alta tensione di 1 - 5 kV. In alternativa, utilizzare un MS disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali/reagenti).
      nota: Utilizzare un filo di rame rettangolare rivestito in poliestere di 0,254 mm di spessore e 6,35 mm di larghezza per fabbricare una bobina fatta in casa. Girare i fili su telai su misura, isolati con fibre di vetro e fusi in resina epossidica (vedi Tabella Materiali/Reagenti). In alternativa, utilizzare bobine disponibili in commercio (vedi Tabella Materiali/Reagenti).

Risultati

Figura 1: Schema dell'impianto utilizzato per la stimolazione magnetica delle colture neuronali. In alto è mostrata la bobina magnetica (cerchi blu), che si trova 5 mm concentricamente sopra la coltura dell'anello neuronale, posta in una capsula di Petri (contorno blu). Una bobina di prelievo (cerchio rosso) posizionata sulla circonferenza della capsula di Petri misura la tensione indotta dall'impuls...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	Soluzione di registrazione extracellulare
D-(+)-glucosio, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Mezzo galvanico, Soluzione di registrazione extracellulare
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Colture cellulari
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F1141	Rivestimento biologico
Fluo4, AM	Tecnologie per la vita	F14201	Imaging di attività spontanea o evocata
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Cambio di mezzo
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1272	Media di placcatura, Mezzo di cambio, Media finale.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Soluzione di registrazione extracellulare
CIAO HS	BI	04-124-1A	Mezzo di placcatura, Mezzo di cambio, Mezzo finale
KCl, 3M	Merck	1049361000	Soluzione di registrazione extracellulare
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	Rivestimento biologico.
MEM x 1	Gibco	21090-022	Mezzo di placcatura, Mezzo variabile, Mezzo finale
Cloruro di magnesio , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Soluzione di registrazione extracellulare
NaCl, 4M	Bio-Laboratorio	19030591	Soluzione di registrazione extracellulare
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	1858	Pulizia dei vetrini coprioggetti rivestiti in Cr-Au (colture 1D)
Saccarosio, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Soluzione di registrazione extracellulare
Uridina	Sigma-Aldrich	U3750	Cambio di mezzo
Macchina sputtering	AJA Internazionale, Inc	ATC Orion-5Series	Rivestimento del vetro con sottili strati di metallo
Plotter a penna	Hewlett Packard	HP 7475A	Incisione del motivo sul vetrino coprioggetti rivestito
Alimentazione	Matrice	MPS-3005 LK-3	Alimentazione alla macchina sputtering
Epossidico	Cognis	Versamid 140	Fusione di bobine fatte in casa
Epossidico	Conchiglia	EPON 815	Fusione di bobine fatte in casa