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Misurazione della fisiologia sinaptica in tempo reale con array multielettrodi (MEA)
1. Prepara i MEA per la coltura cellulare.
- Pulire la superficie di ciascun MEA con 1 ml di detergente per 1 ora. Risciacquare con acqua deionizzata sterile (DI), risciacquare con etanolo al 70% per sterilizzare, quindi asciugare all'aria in una cabina di biosicurezza sotto luce UV.
nota: I MEA possono essere conservati in acqua deionizzata a 4 °C in condizioni sterili fino all'uso.
- Preparare una soluzione 0,5 mg/mL di poliornitina (PLO) sciogliendo 50 mg di PLO in 100 mL di tampone di acido borico. Rivestire la superficie di ogni MEA con 1 mL di PLO per renderlo idrofilo e incubare a 37 °C per un minimo di 4 ore. Rimuovere l'OLP e lavare la superficie con acqua deionizzata.
- Diluire la soluzione di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) con terreno basale (DMEM/F12) per preparare una soluzione madre da 1 mg/mL. Per una soluzione funzionante, risospendere 3 mL di stock ECM in 33 mL di terreno DMEM/F12 pre-raffreddato, portando il volume totale a 36 mL per una concentrazione di 80 μg/mL.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro ECM a ciascun MEA e incubare a 37 °C per un minimo di 4 ore.
- Rimuovere l'ECM e posizionare le sfere in 1,5 mL di terreno su una superficie MEA, assicurandosi che le sfere siano posizionate sopra l'array di elettrodi (Figure 1A, 1A'). Lasciare che il supporto aderisca per 2 giorni. Cambiare metà del supporto ogni 2-3 giorni (o più spesso se necessario), assicurandosi che le sfere non vengano disturbate.
nota: L'aggiunta di fattori di crescita può migliorare la sopravvivenza e la maturazione della coltura.
2. Misura l'attività elettrica delle sfere neurali.
- Configura un sistema a matrice multielettrodo (MEA) con un headstage a temperatura controllata. Creare un programma software con un filtro passa-alto a 5 Hz, un filtro passa-basso a 200 Hz e una soglia di picco di 5 volte la deviazione standard (SD).
- Posizionare il MEA sul palco e registrare l'attività elettrica spontanea (Figura 1B, B'). Salva i dati grezzi, tra cui la frequenza e l'ampiezza dei picchi, per l'analisi statistica.
nota: Un sistema di perfusione può essere utilizzato con il MEA per aggiungere agenti farmacologici o per aumentare il flusso di terreni freschi per la registrazione a lungo termine. Se lo si desidera, è possibile eseguire un'ulteriore post-elaborazione dei picchi.
