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1. Ablazione di una sottopopolazione di neuroni utilizzando un microscopio laser a due fotoni
NOTA: Se gli utenti prevedono di eseguire l'imaging Ca dopo l'ablazione, utilizzare la linea UAShspzGCaMP6s. Se gli utenti prevedono di eseguire la registrazione comportamentale dopo l'ablazione, utilizzare la linea UAS:EGFP, poiché l'ablazione delle cellule EGFP-positive è più facile da eseguire rispetto alle cellule che esprimono GCaMP6s.
- Inizia impostando l'accoppiamento di una linea Gal4 che etichetta neuroni specifici da studiare e UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Assicurati di utilizzare lo sfondo di madreperla per entrambi i genitori in modo che si possano ottenere omozigoti di madreperla.
nota: Gli omozigoti della madreperla non contengono melanofori sulla superficie corporea (Figura 1B). Nel presente studio, vengono utilizzate una linea Gal4 gSAIzGFFM119B (che etichetta il pretectum) e un'altra linea Gal4 hspGFFDMC76A (che etichetta l'ILH).
- Il giorno successivo all'accoppiamento raccogli le uova di zebrafish e allevale fino allo stadio larvale, a quel punto i neuroni di interesse esprimeranno reporter fluorescenti.
- Montare la larva di pesce zebra in agarosio a basso punto di fusione al 2% (Figura 1B).
- Iniziare preparando una soluzione madre di agarosio al 2%: sciogliere 2 g di polvere di agarosio a basso punto di fusione in 100 ml di acqua del sistema (cioè l'acqua utilizzata per mantenere il pesce zebra adulto in un sistema di circolazione dell'acqua) o acqua E3 riscaldando l'acqua fino al punto di ebollizione in un forno a microonde e mescolando energicamente.
- Cuocere nel microonde il 2% di brodo di agarosio a basso punto di fusione fino a quando non bolle. Versare 3,5-4,0 ml di agarosio sul coperchio di una capsula di Petri da 6 cm. Attendere che l'agarosio si raffreddi in modo che sia caldo al tatto prima di procedere.
- Quindi, posizionare una singola larva (non anestetizzata in questa fase) nell'agarosio. Continuare a regolare la posizione e l'orientamento della larva in modo che sia in posizione verticale, utilizzando un ago da dissezione (Figura 1C), fino a quando l'agarosio non si solidifica per garantire il corretto posizionamento della larva.
nota: La larva continuerà a nuotare mentre l'agarosio si solidifica.
- Una volta posizionata la larva, attendere 5 minuti affinché l'agarosio si solidifichi completamente.
- Versare 5 mL di soluzione di tricaina (0,4% a 1 volta la concentrazione di lavoro) sull'agarosio.
nota: Per evitare movimenti da parte delle larve durante l'ablazione laser, le larve devono essere mantenute anestetizzate durante tutta la procedura di ablazione.
- Ablare la larva utilizzando la funzione di sbiancamento in un sistema di microscopia laser a due fotoni.
- Posizionare la larva incorporata nell'agarosio sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni e avviare il sistema di microscopia.
- Avviare il software di acquisizione delle immagini e fare clic sul pulsante "On" nella scheda "Laser" per accendere il laser (Figura 1D). Attendere che lo "Stato" del laser passi da "Occupato" a "Modalità bloccata".
- Nella scheda "Canali", impostare la lunghezza d'onda del laser a 880 nm (potenza massima: circa 2.300 mW) per l'ablazione EGFP o a 800 nm (potenza massima: circa 2.600 mW) per l'ablazione GCaMP.
- Selezionare l'obiettivo 20X spostando manualmente il revolver dell'obiettivo. Fare clic sulla scheda "Localizza", fare clic su "GFP" per modificare i percorsi ottici e visualizzare direttamente la fluorescenza a occhio.
- Individua il cervello larvale del pesce zebra al centro della vista; quindi fai clic sulla scheda "Acquisizione" per tornare alla microscopia a due fotoni.
- Come registrazione della condizione "prima dell'ablazione", scattare un'immagine z-stack con l'obiettivo 20X ad alta velocità di scansione (per evitare danni da calore). Successivamente confrontare le immagini scattate prima e dopo gli esperimenti di ablazione (Figura 2A). Per ottenere uno z-stack, fai clic su "Z-Stack" per selezionare l'opzione z-stack ed espandere la scheda. Imposta il limite inferiore (fai clic sul pulsante "Imposta per primo") dopo aver messo a fuoco l'estremità ventrale del cervello larvale e imposta il limite superiore (fai clic sul pulsante "Imposta ultimo") dopo aver messo a fuoco la superficie dorsale più ampia del cervello. Quindi, fai clic sul pulsante "Avvia esperimento" per eseguire l'acquisizione dell'immagine z-stack.
- Selezionare l'obiettivo 63X spostando manualmente il revolver dell'obiettivo.
- Fare clic sulla scheda "Localizza" per passare alla microscopia epi-fluorescente, individuare le cellule da ablare al centro della vista a occhio, quindi fare clic sulla scheda "Acquisizione" per tornare alla microscopia a scansione laser.
- Nella scheda "Modalità di acquisizione", impostare la "Dimensione fotogramma" su 256 x 256. Fai clic su "Live" e osserva i neuroni di interesse.
- Partendo dal lato più dorsale, trovare un piano focale in cui le cellule da ablare siano a fuoco.
- Contrassegna una piccola area circolare di circa un terzo delle dimensioni della cellula in diametro su ciascun neurone come regione di interesse (ROI) utilizzando la funzione "Regioni".
- Impostare la velocità di scansione su 13,93 s/256 x 256 pixel (134,42 μm x 134,42 μm), che corrisponde a un tempo di permanenza del laser di circa 200 μs/pixel o 200 μs/0,5 μm. Inoltre, imposta 4 ripetizioni ("Ciclo di iterazione: 4"). In alternativa, è possibile ottimizzare il numero di iterazioni e la velocità di scansione in modo da ottenere un'ablazione sufficiente.
- Eseguire la funzione "Bleaching" per l'ablazione, in combinazione con le "Serie temporali (2 cicli)" per visualizzare il campione (prima e dopo l'ablazione) e le "Regioni" (per impostare le ROI) o funzioni equivalenti nel software utilizzato (Figura 1D).
- Confrontando la prima immagine (prima dell'ablazione) e la seconda immagine (dopo l'ablazione) nel ciclo delle serie temporali, assicurarsi che dopo lo sbiancamento, la fluorescenza nelle cellule bersaglio diminuisca a quella osservata a livello di fondo (Figura 2B).
- Se la fluorescenza è ancora presente dopo l'ablazione, aumentare il numero di iterazioni.
- Quindi, sposta il piano focale leggermente più in profondità (cioè verso il lato ventrale) e scegli il piano focale successivo in cui compaiono le cellule non ablate.
- Eseguire la funzione di sbiancamento come descritto sopra (passaggio 1.9). Ripeti questi passaggi fino a quando tutte le cellule della struttura neurale di interesse sono state ablate.
- Dopo aver attraversato tutti i piani focali che coprono le strutture neurali da ablare, controllare le cellule per l'abolizione della fluorescenza. Se alcune cellule risultano ancora fluorescenti a causa di un'ablazione insufficiente, irradiarle nuovamente con il laser come descritto sopra.
- Se la larva deve essere recuperata dall'agarosio dopo l'irradiazione laser, non cercare di forzarla fuori dall'agarosio perché ciò potrebbe danneggiare la larva. Invece, fai con cura piccoli tagli nell'agarosio attorno alla larva perpendicolarmente alla superficie del suo corpo. Quindi, attendi che la larva nuoti da sola fuori dall'agarosio quando l'anestetico svanisce.
- Procedere alla larva successiva per l'ablazione o eseguire esperimenti di controllo utilizzando un'altra popolazione di neuroni che non sono coinvolti nel comportamento in esame.
nota: Qui, come controllo, i neuroni del bulbo olfattivo in UAS:EGFP; Le larve di gSAIzGFFM119B sono state ablate al laser utilizzando lo stesso protocollo descritto sopra (Figura 2A, a destra).
- Attendere diverse ore o 1 giorno per il recupero prima di procedere all'imaging Ca (Sezione 2) o alla registrazione comportamentale (Sezione 3). Durante questo periodo di recupero, controllare la salute delle larve (ad esempio, normale nuoto spontaneo, nessun danno da calore apparente intorno all'area ablata, ecc.) e rimuovere le larve che mostrano segni di cattiva salute.
2. Imaging del calcio per registrare l'attività neuronale evocata dalla preda nelle larve di pesce zebra ablate con pretectum
- Per preparare una camera di registrazione, mettere una guarnizione della camera di ibridazione a tenuta sicura su un vetrino, con il lato adesivo rivolto verso il vetro, e rimuovere la guarnizione superiore.
nota: In questo modo si crea una piccola camera di registrazione di 9 mm di diametro e 0,8 mm di profondità (Figura 3A).
- Quindi, posizionare una rete di nylon (dimensione dell'apertura: 32 μm) su una provetta da 50 ml con il taglio inferiore aperto. Utilizzare il cappuccio per fissare la rete sul tubo (Figura 3B).
- Prepara i parameci (che sono la preda da utilizzare come stimolo visivo per la larva).
nota: Preparare in anticipo la coltura di Paramecium (passaggi 2.3.1 e 2.3.2).
- Procurati in anticipo la coltura di semi di paramecia da fonti commerciali o da centri di biorisorse accademiche.
- Coltivare il paramecio per diversi giorni in acqua contenente paglia di riso autoclavata e una pallina di lievito di birra secco (Figura 3C).
- Versare la coltura di paramecio attraverso 2 setacci in successione (uno con un'apertura di 150 μm, seguito da un altro con un'apertura di 75 μm) per rimuovere i detriti dalla coltura.
- Raccogliere i paramecia nel flusso del passaggio precedente su una rete di nylon (apertura di 13 μm).
- Risospendere i paramecia sulla rete di nylon in un becher di vetro utilizzando una bottiglia da spremere di acqua di sistema (Figura 3D).
- Sciacquare la rete (Figura 3B) in acqua di sistema 2 volte (Figura 3E).
nota: Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere eventuali odori e sapori contenuti nel terreno di coltura del paramecio, poiché l'obiettivo del presente studio è osservare l'attività neuronale guidata visivamente.
- Metti una larva di pesce zebra nella soluzione di tricaina per anestetizzarla.
- Montare una singola larva in agarosio a basso punto di fusione al 2%.
- Innanzitutto, microonde 2% agarosio a basso punto di fusione e aggiungere 1/10 di volume di tricaina concentrata 10x all'agarosio.
- Mettere una goccia di agarosio contenente tricaina sulla camera di registrazione (Figura 3A).
- Dopo aver verificato che l'agarosio non è troppo caldo, posizionare la larva anestetizzata (dal passaggio 2.5) nell'agarosio, rimuovendo immediatamente l'agarosio in eccesso in modo che la superficie dell'agarosio appaia leggermente convessa.
- Orientare rapidamente la larva in posizione eretta con un ago da dissezione (Figura 1C).
nota: Queste procedure devono essere completate entro alcuni secondi prima che l'agarosio si solidifichi.
- Una volta che la larva è posizionata correttamente, attendere 5 minuti affinché l'agarosio si solidifichi completamente. Quindi, versare una goccia di 1x soluzione di tricaina sull'agarosio.
- Rimuovi l'agarosio intorno alla testa della larva del pesce zebra e fai spazio al paramecio per nuotare usando un coltello chirurgico. Per fare ciò, per prima cosa, fai alcuni piccoli tagli nell'agarosio (Figura 3F). Quindi, rimuovere con cura l'agarosio in eccesso versando delicatamente l'acqua del sistema sulla camera.
nota: In questa fase, la tricaina verrà lavata via.
- Quindi, metti un paramecio nella camera di registrazione per fungere da stimolo visivo.
nota: Quando il paramecio nuota vicino alla testa della larva di pesce zebra, evocherà una risposta neuronale (Figura 3G).
- Posizionare la camera di registrazione sotto un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera CMOS scientifica (Figura 3H) e selezionare una lente obiettivo 2,5X (Figura 3I).
- Raccogli registrazioni time-lapse dei segnali di fluorescenza GCaMP.
- Avviare l'applicazione di acquisizione delle immagini per la fotocamera in dotazione.
- Fare clic su "Riquadro sequenza" e selezionare "Record disco rigido" nel riquadro. Nella sezione Impostazioni di scansione, impostare il "Conteggio fotogrammi" su 900 o qualsiasi altro numero di fotogramma totale desiderato.
nota: Se disponibile, utilizzare un software di registrazione time-lapse con un modulo (in questo caso, "Hard Disk Record") che consente un salvataggio efficiente dei dati su un disco rigido.
- Nel riquadro "Acquisizione", impostare il tempo di esposizione su 30 ms (ovvero 33,3 fps) e su Binning 2 x 2.
- Sul pannello a sfioramento di controllo del microscopio, scegliere un set di filtri per GFP, poiché il GCaMP ha spettri di eccitazione/emissione simili a quelli della GFP.
- Fare clic su "Live" nel riquadro Cattura per individuare la larva nella vista della telecamera e mettere a fuoco (Figura 4A), quindi fare clic su "Interrompi live" e fare clic sul pulsante "Start". Salvare il filmato in formato .cxd o in qualsiasi altro formato che contenga informazioni sulla condizione di acquisizione.
