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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Elettrofisiologia
NOTA: L'obiettivo di questo protocollo è ottenere registrazioni di current-clamp di cellule intere di cellule piramidali di strato II/III identificate visivamente dall'espressione di GFP in cervelli di topo elettroporati GFP (o qualsiasi altra proteina fluorescente precedentemente elettroporata). Utilizzando questo protocollo, è possibile studiare l'effetto di una modificazione genetica introdotta dall'IUE sulle proprietà elettriche del neurone. L'acquisizione di specifiche modalità di attivazione è un processo graduale di differenziazione che coinvolge l'espressione dinamica di un ampio repertorio di canali ionici e che si traduce nell'espressione di modalità di attivazione transitorie prima delle fasi tardive del postnatale. Ad esempio, le risposte elettriche mature non sono osservate negli strati II/III della corteccia somatosensoriale del topo prima di P16.
- Presupposti per le fette acute
- Preparare 1 L di ACSF utilizzando acqua ad alta purezza (doppia distillazione) contenente 119 mM di NaCl, 26 mM di NaHCO3, 11 mM di glucosio, 2,5 mM di KCl, 1,2 mM di MgCl2, 2,5 mM di CaCl2 e 1 mM di NaH2PO4. Titolare il pH a 7,3 - 7,4 con HCl o NaOH. Regolare l'osmolarità a 290 mOsm.
- Bollire ACSF con carbogeno (95% Ø2/5% CO2) per 15 - 20 minuti utilizzando tubi di teflon (~ 1 mm), per stabilizzare il pH a 7,3 - 7,4.
- Prerequisiti per la registrazione dell'intera cellula
- Assicurarsi che la stazione di elettrofisiologia sia dotata di una camera di registrazione, un sistema di perfusione, un microscopio, elettrodi (di registrazione, stimolanti e di messa a terra), macro e micromanipolatori, un tavolo rigido resistente alle vibrazioni e una gabbia di Faraday, uno stimolatore, un amplificatore e un convertitore analogico-digitale (A/D), un computer con software di acquisizione e un filtro GFP (o qualsiasi altro fluorocromo) per l'analisi dei neuroni geneticamente modificati (Figura 1A).
- Preparare la soluzione intracellulare, contenente 115 mM di gluconato di potassio, 2 mM di MgCl2, 10 mM di HEPES, 20 mM di KCl, 4 mM di Na2ATP e 0,3 mM di Na3GTP, regolata a pH 7,2 mediante KOH e a 290 mOsm mediante KCl.
- Realizzare pipette patch tirando i capillari in vetro borosilicato. Preparare gli elettrodi patch utilizzando un estrattore per micropipette. Utilizzare capillari borosilicati (diametro esterno 1,5 mm, diametro interno 0,86 mm, lunghezza 10 cm). Realizzare elettrodi patch che mostrino resistenze di 3-10 MΩ quando riempiti con soluzione intracellulare.
- Perfondere la camera di registrazione con ACSF a una velocità di 2 mL/min. Mantenere la temperatura della camera a circa 33 °C.
- Registrazione di intere cellule
- Trasferire le fette nella camera di registrazione utilizzando una pipetta Pasteur (tagliare la punta lunga) o un pennellino. Tenere premuta la fetta con un'arpa. Perfondere costantemente le fette con ACSF a una velocità di 2 mL/min.
- Patch a un neurone GFP-positivo.
- Inserire la fetta nella camera di registrazione e trovare l'area di interesse attraverso il microscopio a basso ingrandimento (10X). Quindi, trova una cellula positiva alla GFP da applicare utilizzando l'obiettivo 60x.
- Riempire l'elettrodo di registrazione con una soluzione intracellulare. Utilizzare la siringa collegata al filtro (filtro da 4 mm) e la punta del microcaricatore per riempire l'elettrodo di registrazione con la soluzione intracellulare.
- Posizionare la pipetta di vetro nel portapipetta. Posizionare la punta della pipetta nella vasca da bagno e concentrarsi sulla punta. Una volta che la pipetta è nel bagno, applicare una pressione positiva attraverso il sistema di controllo della contropressione.
- Applicare un cerotto a un neurone fluorescente (Figura 1B).
- Avvicinarsi alla cellula di interesse sotto guida visiva mantenendo la contropressione nella pipetta. Alla comparsa di una piccola fossetta sulla superficie cellulare, rilasciare la pressione. A questo punto, può formarsi una tenuta ermetica (resistenza superiore a 1 GΩ). In caso contrario, applicare una leggera pressione negativa (aspirazione) per facilitarla.
- Durante la formazione della guarnizione, portare la tensione di mantenimento clamp a -60 mV. Una volta formato il sigillo GΩ, applicare un impulso di aspirazione per rompere la membrana cellulare sotto la pipetta e passare alla modalità a cellula intera.
- Registrare l'attività utilizzando le condizioni di pinza di corrente. Una volta in modalità cella intera, passa dalla modalità voltage-clamp alla modalità current-clamp e avvia la registrazione. Ad esempio, per registrare l'eccitabilità cellulare, applicare iniezioni di corrente depolarizzante lunghe 500 ms (100 - 400 pA).
- Calcola le velocità di accensione tracciando il numero di potenziali d'azione lungo il treno per aumentare le correnti di ingresso.
nota: Dalle registrazioni possono essere calcolati anche il potenziale di membrana a riposo, la resistenza di ingresso e la capacità della membrana.
