Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Suinetti e gestione dei suinetti
- Utilizzare suinetti maschi e femmine in modo sistematico e randomizzato per eliminare qualsiasi potenziale fattore confondente basato sul sesso in conformità con le linee guida ARRIVE.
NOTA: Poiché il periodo di massima crescita cerebrale è entro 3-5 giorni dalla nascita dei suinetti, la sperimentazione viene eseguita esclusivamente con suinetti di 3-5 giorni.
- Assicurarsi che i suinetti arrivino nel vivaio almeno 24 ore prima della sperimentazione per consentire l'acclimatazione all'ambiente.
nota: Il personale veterinario qualificato fornisce cure di routine agli animali. I suinetti sono tenuti in gabbie a temperatura mantenuta individualmente e continuamente monitorate e ricevono un sostituto del latte completo dal punto di vista nutrizionale ad libitum per prevenire l'ipoglicemia. I suinetti vengono inoltre tenuti senza sostituti del latte (nil per os), per almeno 3 ore prima dell'anestesia e vengono forniti con coperte e giocattoli per garantire normali livelli di stimolazione. Se possibile, tieni più suinetti nella stessa gabbia per consentire la socializzazione.
2. Sviluppo e personalizzazione di array di microelettrodi (MEA) per studi di neurotossicità indotta da anestesia (AIN) in un modello di suinetto
NOTA: Questa tecnologia utilizza MEA basati su enzimi che sono pre-rivestiti con enzima ed elettrodeposti con m-fenilendiammina dicloridrato (mPD). Gli elettrodi sono stati progettati su misura con uno stelo rigido da 40 mm e prodotti per l'uso nei suinetti (Figura 1).
- Si prega di consultare la descrizione dettagliata della preparazione e della calibrazione MEA (Figura 2).
3. Anestesia e uso di apparecchi stereotassici personalizzati per il maialino
- Anestetizzare gli animali utilizzando una workstation per anestesia con un ventilatore appropriato e dispositivi di monitoraggio e monitorare parametri fisiologici come pulsossimetria, pressione sanguigna non invasiva, elettrocardiografia e temperatura per l'intera durata dell'esperimento, come descritto in precedenza. Intubare e ventilare i suinetti e somministrare l'anestesia con sevoflurano a 1 concentrazione alveolare minima (MAC) (circa 2,5-3%) per 3,5 ore. Assicurarsi che per questi esperimenti sia presente personale di laboratorio addestrato. Il pelo sovrastante l'area chirurgica viene rimosso utilizzando tosatrici elettriche prima della preparazione della pelle.
nota: La concentrazione e la durata dell'anestetico utilizzato consentono all'esperimento di simulare la durata dell'effettiva esposizione all'anestesia durante una procedura chirurgica. Inoltre, il sevoflurano è l'anestetico generale più comunemente utilizzato nella popolazione pediatrica, il che rende l'indagine sulla sua sicurezza della massima importanza.
- Prima del posizionamento nel telaio stereotassico, iniziare una dose di carico di rocuronio di 2,5 mg/kg e un'infusione di 1,5 mg/kg/h per prevenire il movimento dell'animale mentre è fissato nel telaio.
- Posizionare il suinetto nel quadro stereotassico specifico del suinetto una volta che un'adeguata profondità di anestesia è confermata dal pizzicamento delle dita.
- Fornire un'adeguata imbottitura all'interno del telaio stereotassico posizionando il suinetto su un cuscinetto riscaldante ad aria forzata con imbottitura aggiuntiva (ad esempio, posizionatore fluidizzato) per prevenire ulcere da pressione.
- Posizionare i denti della mandibola superiore sopra la barra dei denti (Figura 3).
nota: La barra dentale dovrebbe essere a un livello sufficiente per tenere il cranio molto saldamente in posizione.
- Fissare e stringere le barre auricolari penetranti all'interno delle orecchie, facendo attenzione che il suinetto sia in posizione della linea mediana. Posizionare le punte appuntite delle prese laterali all'interno del condotto uditivo e inserire le barre auricolari abbastanza saldamente da sentire il suono "pop" associato alla penetrazione della membrana timpanica. Fissare saldamente le barre auricolari al cranio e inserirle alla stessa profondità su ciascun lato per impedire il movimento del cranio durante l'esperimento (Figura 4, Pannello A).
nota: È di vitale importanza mantenere il suinetto al caldo (~ 37,8-38,6 °C) e monitorare continuamente la temperatura durante l'intera procedura per il mantenimento della normotermia. Questo può essere ottenuto tramite una coperta e/o una lampada termica. Assicurati di posizionare la lampada riscaldante a una distanza adeguata per evitare di bruciare la pelle dell'animale.
- Crea un'incisione della linea mediana di 4-6 cm lungo il cranio facendo attenzione per evitare di segnare il cranio con il bisturi. Una volta praticata l'incisione, utilizzare una retrazione delicata e una dissezione smussata per sollevare il cuoio capelluto dal cranio. Strofinare delicatamente il cranio con una garza per rimuovere il tessuto connettivo ed esporre le linee di sutura (Figura 4, Pannello B).
nota: Non è necessario mantenere la sterilità durante gli esperimenti di non sopravvivenza. Tuttavia, la sterilità deve essere mantenuta durante gli esperimenti di sopravvivenza.
- Riflettere ulteriormente il cuoio capelluto, se necessario, per esporre l'area di interesse e determinare la posizione prevista per la craniotomia (Figura 5, Pannello A). Utilizzare un trapano chirurgico per creare una finestra craniotomica di circa 0,25cm2 (può essere più grande o più piccola a seconda degli obiettivi sperimentali) sovrastante la struttura di interesse, facendo attenzione a non danneggiare la dura madre o il cervello sottostante (Figura 5, Pannello B). Utilizzare forbici chirurgiche sottili per asportare la dura madre sovrastante il tessuto cerebrale (Figura 5, Pannello C).
- Posizionare l'elettrodo il più verticalmente possibile sopra la bregma fissando il braccio metallico dell'headstage al micromanipolatore del suinetto stereotax. Abbassare l'elettrodo il più possibile senza toccare la superficie del cranio. Registrare le coordinate della bregma (Figura 6, Pannello A).
- Determinare le coordinate antero-posteriore e mediale-laterale, nonché la profondità della struttura di interesse in relazione al bregma. Determinare le coordinate stereotassiche utilizzando un atlante stereotassico adatto alla specie e all'età. In questo caso, utilizzare un atlante stereotassico sviluppato appositamente per i suinetti.
- Riposizionare l'elettrodo in modo che abbia la corretta posizione antero-posteriore e mediale-laterale, assicurandosi che sia il microelettrodo che l'apparato siano perpendicolari alla superficie. Posizionare l'elettrodo di pseudo-riferimento sotto il cuoio capelluto, assicurando il contatto con l'animale (Figura 6, Pannello B).
- Lentamente e delicatamente, abbassare l'elettrodo alla profondità appropriata nel cervello utilizzando il braccio stereotassico. Per gli ultimi 2 mm, utilizzare un microazionamento idraulico per guidare ulteriormente l'elettrodo nella posizione esatta (Figura 6, Pannello C).
nota: La posizione dell'elettrodo deve sovrapporsi alla finestra craniotomica. La profondità dell'elettrodo varierà a seconda della struttura cerebrale di interesse. Non è necessario chiudere l'incisione al termine della raccolta dei dati negli esperimenti di non sopravvivenza.
4. Misurazione del glutammato extracellulare in anestesia con sevoflurano
- Assicurarsi che il suinetto sia sottoposto a un monitoraggio fisiologico continuo durante l'intera procedura. I suinetti vengono anestetizzati per via inalatoria (tramite il cono facciale) in preparazione alla procedura.
- Dopo l'impianto del MEA, attendere 30 minuti per consentire all'elettrodo di raggiungere la linea di base per garantire che si ottenga una misurazione corretta per 3 ore (Figura 7).
- La bupivacaina allo 0,25% (1 ml/kg) viene somministrata per via sottocutanea nel sito dell'intervento chirurgico per la gestione del dolore postoperatorio. Inoltre, la buprenorfina a rilascio prolungato viene somministrata per via sottocutanea ogni 72 ore secondo necessità.
