Registrazione dell'attività neurale del tessuto ippocampale dispiegato utilizzando un array di microelettrodi penetranti

Abstract

Fonte: Zhang, M., et al. Propagazione dell'attività neurale in una preparazione ippocampale dispiegata con un array di microelettrodi penetranti. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra la procedura per configurare una camera di registrazione con un array di microelettrodi penetranti (PMEA) per catturare segnali neurali da un ippocampo aperto. Questo metodo ci permette di studiare la velocità e la direzione di propagazione dell'attività neurale all'interno dell'ippocampo dispiegato in vitro.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dall'appropriata revisione etica degli animali.

1. Soluzioni per la chirurgia e la registrazione sperimentale

1. Preparare un tampone normale per il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) contenente (mM) NaCl (cloruro di sodio) 124, KCl (cloruro di potassio) 3,75, KH₂PO₄ (fosfato monobasico di potassio) 1,25, MgSO₄ (solfato di magnesio) 2, NaHCO₃ (bicarbonato di sodio) 26, destrosio 10 e CaCl₂ (cloruro di calcio) 2. Utilizzare questo normale aCSF per il recupero dei tessuti dopo la dissezione e per il sistema di lavaggio all'inizio dell'esperimento.
2. Preparare il saccarosio aCSF che viene utilizzato durante la dissezione dell'ippocampo e contiene (mM): saccarosio 220, KCl 2,95, NaH₂PO₄ (fosfato monobasico di sodio) 1,3, MgSO₄ 2, NaHCO₃ 26, destrosio 10 e CaCl₂ 2. Al fine di indurre l'attività epilettiforme nella preparazione del tessuto ippocampale intatto, aggiungere 4-aminopiridina (4-AP) all'aCSF normale alla concentrazione di 100 μM.

2. Posizionamento dell'ippocampo aperto sull'array di microelettrodi penetranti (PMEA) per registrare l'attività neurale

1. Per preparare la configurazione sperimentale, riempire un flacone con aCSF normale e un altro flacone con 4-AP aCSF. In entrambe le bottiglie, bollire il 95% O₂/ 5% CO₂ fin dall'inizio di ogni esperimento. Utilizzare un connettore a tre valvole per controllare quale soluzione verrà selezionata durante un esperimento. Collegare un tubo a vuoto all'uscita della camera per pompare la soluzione in un contenitore per la polvere. Riscaldare la tubazione prima di consegnarla nella camera di registrazione e mantenere la soluzione a un livello di temperatura controllato (35 °C).
2. Quando l'ingresso e l'uscita della camera di registrazione sono chiusi, utilizzare un contagocce per pipette in vetro su misura per trasferire e posizionare l'ippocampo aperto nella camera. Al microscopio, posizionare l'ippocampo aperto utilizzando un normale pennello mentre il tessuto galleggia nella soluzione. Posiziona l'ippocampo aperto con il lato alveo rivolto verso il basso, l'area CA3 rivolta verso l'esterno e il campo CA1 rivolto verso il ricercatore.
3. Aspirare con cautela la soluzione nella camera utilizzando una pipetta a vuoto dal bordo della camera di registrazione per abbassare il livello della soluzione fino a quando la camera non si asciuga e il tessuto viene abbassato sull'array. Quindi, posizionare con cura un ancoraggio tissutale su misura (Figura 1) (n. 7 in Materiali e attrezzature specifiche) sopra il tessuto per trattenere l'ippocampo aperto sull'array. Mettere alcune gocce di soluzione nella camera di registrazione per riempirla e aprire gradualmente l'ingresso e l'uscita per regolare la portata a circa due gocce al secondo nella camera di gocciolamento IV.
4. Incubare il tessuto nella camera di registrazione con aCSF normale per circa 1 minuto per recuperare, quindi passare l'alimentazione della soluzione all'aCSF disciolto 4-AP e regolare correttamente la velocità di flusso. Incubare il tessuto in aCSF disciolto in 4-AP per circa 5-10 minuti, quindi il ricercatore potrebbe avviare il software per registrare il segnale quando appare l'attività spontanea.

Risultati

Figura 1. Configurazione sperimentale. (A) Un coperchio di plastica con viti è posizionato sopra i circuiti per proteggerlo da possibili danni causati dall'acqua. La camera di registrazione è dotata di tubi di ingresso e di uscita per trasportare il flusso della soluzione. Un ancoraggio tissutale su misura incollato con una rete in fibra di nylon viene utilizzato per fissare il tessuto durante gli es...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pennello piccolo	Lowe's	tem #: 105657 Modello #: 90219	Quello con le dimensioni più piccole in una normale confezione di pennelli
Strumento di aiuto in vetro lucidato a fuoco	N/A	N/A	Questo strumento è stato lucidato a fuoco e realizzato con le normali pipette di vetro Pasteur.
Ago di vetro su misura	N/A	N/A	Questo strumento è stato lucidato a fuoco e realizzato con le normali pipette di vetro Pasteur.
Utensile in vetro su misura con un anello di filo metallico	N/A	N/A	Questo strumento è stato lucidato a fuoco e realizzato con le normali pipette in vetro Pasteur con un anello di filo metallico rimodellato.
Contagocce per soluzioni in vetro su misura	N/A	N/A	Questo strumento è stato ricavato dalle normali pipette di vetro Pasteur con le punte tagliate e una testina di gomma attaccata all'estremità tagliata.
Ancora in tessuto su misura	N/A	N/A	La rete in fibra di nylon è stata incollata su un anello di filo di rame isolato. L'ancora tissutale è stata trattenuta da un micromanipolatore.
Array di microelettrodi fabbricato su misura	N/A	N/A	Maggiori dettagli sull'array si prega di fare riferimento a Kibler, et al, 2011.
Circuiti di filtri e amplificatori su misura per l'array	N/A	N/A	Maggiori dettagli sull'array si prega di fare riferimento a Kibler, et al, 2011.
Processore di acquisizione dati 3400a	Laboratori Microstar	N/A	Si tratta di un sistema completo di acquisizione dati con convertitore A/D.