Preparazione di un modello di ratto per valutare l'integrità del percorso visivo utilizzando una configurazione di elettrofisiologia

Abstract

Fonte: Nguyen, C. T. et al., Registrazione simultanea di elettroretinografia e potenziali evocati visivi in ratti anestetizzati.J. Vis. Exp. (2016)

Questo video dimostra la preparazione di un modello di ratto per studiare la salute della retina e l'integrità del percorso visivo. Il potenziale evocato visivo e il riferimento per l'elettroretinografia e gli elettrodi attivi sono collegati al ratto, seguiti dall'allineamento della piattaforma con il ratto davanti alla ciotola di Ganzfeld per un'illuminazione uniforme della retina e dalla chiusura della gabbia di Faraday per evitare interferenze esterne.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preimpianto di elettrodi a potenziale evocato visivo cronico (VEP)

NOTA: Se devono essere raccolti segnali concomitanti di elettroretinogramma (ERG) e VEP, gli animali devono essere impiantati chirurgicamente con elettrodi VEP almeno 1 settimana prima della raccolta del segnale.

1. Sterilizzare il banco operatorio prima della sperimentazione mediante pulizia con clorexidina (0,5% in etanolo al 70%). Autoclavare tutte le apparecchiature chirurgiche prima dell'uso. Copri l'animale con un telo chirurgico sterilizzato. Assicurati che tutti gli sperimentatori indossino maschere chirurgiche, camici e guanti sterilizzati.
2. Indurre l'anestesia con isoflurano al 3 - 3,5% con O₂ a una velocità di flusso di 3 L/min. Mantenere l'anestesia all'1,5% e 2 L/min per tutta la durata dell'intervento. Garantire una profondità sufficiente dell'anestesia grazie all'assenza di riflesso di pizzicamento della zampa.
3. Applicare carbossimetilcellulosa sodica all'1% sulla cornea per prevenire la secchezza degli occhi.
4. Radere un'area di 30 mm x 30 mm sulla fronte, posteriormente agli occhi e anteriormente alle orecchie.
5. Posizionare l'animale su un cuscinetto termico (37°C) per mantenere la temperatura corporea e stabilizzare la testa dell'animale con un telaio stereotassico.
6. Disinfettare l'area rasata con il 10% di iodio povidone tre volte. Per la zona vicino all'occhio, evitare l'uso di antisettici a base alcolica, in linea con lo Standard of Practice stabilito dall'Association of Surgical Technologists.
7. Praticare un'incisione mediano-sagittale sulla testa con un bisturi e da questo asportare un cerchio di tessuto dermico di ~ 20 mm di diametro per esporre l'osso cranico.
8. Rimuovere il periostio sottostante raschiando e asciugando con una garza per esporre le suture craniche coronali e sagittali.
9. Utilizzando una fresa dentale attaccata a un trapano, praticare due fori (0,7 mm di diametro, profondità ~ 1 mm) attraverso il cranio su entrambi gli emisferi alle coordinate stereotassiche: 7 mm caudale alla bregma, 3 mm lateralmente alla linea mediana.
10. Avvitare le viti in acciaio inox (diametro 0,7 mm, lunghezza 3 mm, sterilizzate con clorexidina) nei due fori prefabbricati fino a una profondità di ~ 1 mm (2 mm di vite esposta) per consentire un ancoraggio stabile. Questo entra in contatto con la dura madre senza danneggiare il tessuto corticale sottostante.
11. Preparare l'area chirurgica per l'amalgama dentale asciugando l'osso cranico con una garza e ritraendo la pelle flaccida con due suture 3 - 0 a ~ 4 e 8 ore
.
12. Stendere l'amalgama dentale sul cranio esposto per fissare in posizione gli elettrodi a vite (viti in acciaio inossidabile descritte al punto 1.10). Assicurarsi che ~ 1,5 mm delle viti rimangano esposte per la registrazione.
13. Rimuovere i punti di sutura di retrazione.
14. Iniettare lo 0,5% di carprofene per via sottocutanea (5 mg/kg) per analgesia e soluzione fisiologica (cloruro di sodio 0,9%, 1,5 ml) per via sottocutanea per la sostituzione dei fluidi.
15. Consenti agli animali di riprendersi in gabbie separate. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
16. Non restituire l'animale in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso dall'intervento chirurgico (minimo 5 giorni).
17. Continuare a somministrare carprofene allo 0,5% per via sottocutanea per analgesia (5 mg/kg) una volta al giorno per 4 giorni.
18. Registrare ERG e VEP 1 settimana dopo l'intervento.

2. Registrazione ERG e VEP

1. Preparazione alla raccolta dei dati
   1. Utilizzare il software del computer per attivare contemporaneamente lo stimolo e acquisire i dati in base alle impostazioni consigliate di seguito.
      1. Amplifica i segnali (ERG: ×1.000, VEP: x10.000) con il guadagno impostato internamente da un preamplificatore e un amplificatore isolati e con entrambi gli occhi abbinati per l'impedenza.
      2. Impostare la frequenza di campionamento per l'ERG a 4 kHz su una finestra di registrazione di 650 msec (2.560 punti), Per fare ciò, fare clic sulla scheda per "base temporale" nel software di acquisizione dati (per il nome e la versione del software vedere la tabella per i materiali), selezionare "2.560" per Campioni e "500 ms" per il tempo che restituirà una finestra di registrazione di 650 msec.
         1. Utilizzare lo stesso metodo per impostare la frequenza di campionamento per il VEP a 10 kHz in un'epoca di 250 msec. Consentire un basale pre-stimolo di 10 msec sia per le registrazioni ERG che VEP. Per fare ciò, fai clic sulla scheda "Configurazione"; seleziona "Stimolatore" per visualizzare una nuova finestra di dialogo; in quella finestra seleziona "impulso" dall'elenco a discesa per "Modalità"; e impostare il valore di "Ritardo" su "10 ms".
      3. Impostare il filtraggio passa-banda ERG su 0,3 - 1.000 Hz (- 3 dB). Questo viene fatto facendo clic su "Bio Amplifier" nel software di acquisizione dati. Quindi impostare il valore di "Passa alto" su "0,3 Hz" e il valore di "Passa basso" su "1 kHz".
      4. Utilizzando il metodo sopra menzionato in 2.1.1.3, impostare le impostazioni passa-banda VEP su 0,1 - 100 Hz (- 3 dB) come raccomandato dalla Società Internazionale per l'Elettrofisiologia Clinica della Visione (ISCEV) per le registrazioni VEP umane.

2. Preparazione dell'elettrodo

1. Personalizzare gli elettrodi ERG attivo/inattivo e VEP attivo/inattivo collegando rispettivamente un filo d'argento o una clip a coccodrillo a un elettrodo. Ottenere in commercio l'elettrodo di terra.
2. Per i 4 elettrodi su misura, tagliare l'estremità maschio dalla prolunga dell'elettrodo. Rimuovere 1 cm del rivestimento isolante esterno in politetrafluoroetilene con una lama di bisturi assicurandosi che il filo interno non venga danneggiato.
3. Pre-modellare gli elettrodi inattivi ERG tagliando una lunghezza di 70 mm di filo d'argento (0,3 mm di spessore) e formando un anello di ~ 8 mm di diametro per circondare l'occhio del ratto. Preparare un cerchio uniforme modellando l'anello su un puntale per pipetta da 1 ml.
4. Pre-modellare gli elettrodi inattivi VEP tagliando una lunghezza di 70 mm di argento e formando un'ellisse di ~ 8 mm di diametro longitudinale da agganciare agli incisivi di ratto.
5. Pre-modellare gli elettrodi attivi ERG tagliando un filo d'argento lungo 30 mm e formando un piccolo anello per entrare delicatamente in contatto con la cornea di ratto (~ 1-2 mm di diametro)
6. Fissare saldamente gli elettrodi (2 ERG attivi, 2 ERG inattivi, 1 VEP inattivo) al cavo dell'elettrodo intrecciando l'argento con il filo interno esposto.
7. Isolare il metallo esposto in eccesso con nastro adesivo per ridurre gli artefatti fotovoltaici.
8. Sugli elettrodi inattivi ERG, incollare un piccolo pezzo di chiusura a strappo (~ 5 mm × 20 mm) al nastro adesivo per consentire un fissaggio stabile alla cinghia del collo del roditore.
9. Collegare la clip a coccodrillo al filo interno dei cavi dell'elettrodo per rendere attivi gli elettrodi VEP.
10. Prima delle registrazioni, placcare le superfici esposte dei fili d'argento (cioè l'anello inattivo e la punta attiva) con cloruro utilizzando una sorgente a 9 V CC per 20 secondi per migliorare la conduzione del segnale.
    1. Per fare ciò, immergere la punta d'argento del filo dell'elettrodo ERG (che funge da anodo di una cella primaria) in una soluzione fisiologica normale e collegare l'altra estremità di questo filo dell'elettrodo al terminale positivo di una batteria da 9 V.
    2. Collegare un altro filo (il catodo) al terminale negativo della batteria e immergere anche l'altra estremità nella soluzione fisiologica. Scollegare dopo 20 secondi e osservare che la punta argentata del filo dell'elettrodo ERG sia rivestita uniformemente di colore bianco.
       NOTA: Preparare nuovi elettrodi ERG per ogni sessione sperimentale (~ fino a 8 ore) per garantire la pervietà del rivestimento di cloruro.

3. Preparazione degli animali

1. Adattare gli animali al buio durante la notte (≥ 8 ore) prima delle registrazioni in una stanza a tenuta di luce. Garantisci il massimo adattamento al buio spegnendo le luci della stanza e chiudendo tutte le porte e le persiane. Riduci al minimo la dispersione di luce posizionando materiali a prova di luce attorno alle giunzioni di porte/finestre e posizionando schermi di computer all'esterno di spesse tende nere.
2. Condurre la preparazione degli animali in una stanza buia con l'aiuto di un diodo a emissione di luce rossa fioca (LED; 17,4 cd.m-2, λ_max = 600 nm) per sostenere la sensibilità dei bastoncelli.
3. Anestetizzare il ratto iniettando ketamina/xilazina (60: 5 mg/kg) per via intramuscolare. Confermare una profondità sufficiente dell'anestesia dall'assenza di un riflesso di pizzicamento della zampa.
4. Per mantenere la sedazione, somministrare un'ulteriore dose di anestesia (50% della dose iniziale) dopo 50 minuti, se necessario.
5. Per un'ulteriore anestesia topica, applicare una goccia di proxymetacaina allo 0,5% su ciascun occhio e sbattere le palpebre per eliminare il liquido in eccesso.
6. Per la dilatazione della pupilla applicare una goccia di tropicamide allo 0,5% su ciascun occhio, quindi asciugare il liquido in eccesso.

4. Posizionamento degli elettrodi ERG e VEP

1. Posizionare l'animale sulla piattaforma ERG davanti alla ciotola Ganzfeld situata nella gabbia di Faraday. Evitare l'uso di un termoforo elettrico, in quanto può introdurre rumore elettrico nelle registrazioni elettrofisiologiche.
   NOTA: La piattaforma è collegata a una piattaforma di acqua riscaldata a circolazione per mantenere la temperatura corporea.
2. Fissare l'animale alla piattaforma con una striscia di chiusura a strappo posizionata saldamente ma non strettamente intorno alla nuca.
3. Agganciare l'elettrodo VEP inattivo attorno agli incisivi inferiori del ratto anestetizzato.
4. Posizionare gli elettrodi inattivi ERG circondando l'anello sclerale in modo non invasivo attorno all'equatore dell'occhio. Stabilizzare questo aspetto collegando gli elettrodi alla striscia di fissaggio a strappo intorno alla nuca. Ripetere per l'occhio controlaterale.
5. Fissare gli elettrodi attivi VEP fissando le clip a coccodrillo alle viti in acciaio inossidabile preimpiantate sul cranio.
6. Posizionare una piccola goccia di carbossimetilcellulosa sodica all'1% sulla cornea prima del posizionamento dell'elettrodo attivo ERG per migliorare la qualità del segnale.
   NOTA: Il fluido viscoso aiuta anche a mantenere l'idratazione corneale durante la sperimentazione per ridurre al minimo la formazione di cataratta di tipo essiccante nei roditori.
7. Posizionare una piccola goccia di carbossimetilcellulosa sodica all'1% sugli incisivi inferiori per migliorare il contatto dell'elettrodo inattivo VEP e quindi la qualità del segnale.
8. Posizionare gli elettrodi attivi ERG in modo che tocchino leggermente la superficie corneale centrale utilizzando un micromanipolatore collegato a un braccio stereotassico personalizzato.
9. Inserire 2 - 5 mm dell'elettrodo dell'ago di messa a terra (acciaio inossidabile) per via sottocutanea nella coda.
10. Se necessario, asciugare il liquido in eccesso dalla palpebra inferiore prima della registrazione per migliorare la qualità del segnale.
11. Far scorrere la piattaforma più vicino alla ciotola di Ganzfeld assicurandosi che gli occhi dell'animale siano allineati con l'apertura della ciotola per consentire un'illuminazione uniforme di entrambe le retine (vedere il passaggio 2.4.1).
12. Chiudere la gabbia di Faraday per ridurre il rumore estraneo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clip a coccodrillo	Marca generica	HM3022	Clip in acciaio inox da 26 mm per il collegamento di elettrodi a vite VEP ai cavi
Bioamplificatore	STRUMENTI AGGIUNTIVI	ML 135	Per amplificare i segnali ERG e VEP
Carbossimetilcellulosa sodica 1,0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Fluido viscoso per migliorare la qualità del segnale dell'elettrodo ERG attivo
Carprofene 0,5%	Gruppo per la salute animale Pfizer	CAS 53716-49-7	Nome commerciale: Rimadyl iniettabile (50 mg/mL). Per l'analgesia post-operatoria, diluito allo 0,5% (5 mg/mL) in soluzione fisiologica normale
Clorexadina 0,5%	Laboratori Orion	Codice 27411, 80085	Per la disinfezione di strumenti chirurgici
Bagnomaria circolante	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Per il mantenimento della temperatura corporea dell'animale anestetizzato durante l'intervento chirurgico e le registrazioni elettrofisiologiche
Amalgama dentale	DeguDent GmbH	64020024	Per incastrare il gruppo elettrodo-cranio per renderlo più robusto
Fresa dentale	Storz Instruments, Bausch e Lomb	#E0824A	Una testa di perforazione in miniatura di ~0,7 mm di diametro per praticare un piccolo foro nel cranio su ciascun emisfero per impiantare viti VEP
trapano	Bosch	Dremel serie 300	Un trapano automatico per la trapanazione
Elettrodo	Telefattore Erba	F-E2-30	Cavi in platino per il collegamento di elettrodi in filo d'argento all'amplificatore
Gabbia di Faraday	Personalizzato		Garantisce la resistenza alla luce per mantenere l'adattamento al buio. Racchiude la configurazione Ganzfeld per migliorare il rapporto segnale/rumore
Tamponi di garza	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100B	Per asciugare l'incisione chirurgica e la superficie esposta del cranio durante l'intervento chirurgico
Sfera integratrice di Ganzfeld	Soluzioni fotometriche internazionali		Stimolatore di luce progettato su misura: diametro 36 mm, apertura 13 cm
VELCRO	VELCRO Australia Pty Ltd	Involucro riutilizzabile di marca in VELCRO	Chiusura a strappo per fissare gli elettrodi e l'animale sulla piattaforma di registrazione
Isoflurano 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Nome proprietario: Isoflo(TM) Anestetico per inalazione. Anestetico per inalazione di grado farmaceutico miscelato con ossigeno gassoso per la chirurgia implantare di elettrodi VEP
Ketamina	Laboratori Troy	Ilium Ketamil	Nome proprietario: Ketamil Injection, Marca: Ilium. Anestetico di grado farmaceutico per la registrazione elettrofisiologica
LED Luxeon	Phillips Lighting Co.		Per la stimolazione della luce venti LED da 5 watt e uno da 1 watt.
Micromanipolatore	Apparato di Harvard	BS4 50-2625	Mantiene l'elettrodo attivo ERG durante le registrazioni
Elettrodo ad ago	Telefattore Erba	F-E2-30	Inserito per via sottocutanea nella coda per fungere da elettrodo di terra sia per l'ERG che per il VEP
Fenilefrina 2,5% minimo	Bausch e Lomb	CAS 61-76-7	Instillato con Tropicamide per ottenere la massima dilatazione per la registrazione ERG
Iodio povidone 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nome proprietario: Betadine, Antisettico per preparare la pelle rasata per l'intervento chirurgico 10%, 500 ml
Sistema di acquisizione dati Powerlab	STRUMENTI AGGIUNTIVI	Visualizzazione del materiale ML 785	Controlla i LED
Proxymetacaina 0,5%	Laboratori Alcon	CAS 5875-06-9	Per l'anestesia corneale durante le registrazioni ERG
Soluzione salina	Gelflex		Non iniettabile, per elettrodi a filo d'argento galvanico
Software per cannocchiale	STRUMENTI AGGIUNTIVI	Versione 3.7.6	Attiva contemporaneamente lo stimolo tramite il sistema Powerlab e raccoglie i dati
Argento (filo rotondo fine)	A & E metallo	0,3 millimetri	Utilizzato per realizzare elettrodi ERG attivi e inattivi e l'elettrodo VEP inattivo
Viti a strisciamento in acciaio inox	MicroFasterners		Diametro dello stelo di 0,7 mm, lunghezza 3 mm da impiantare sulla corteccia visiva primaria e fungere da elettrodi VEP attivi
Fotogramma stereotassico	David Kopf	Modello 900	Uno strumento stereotassico per piccoli animali per localizzare le cortecce visive primarie secondo le coordinate dell'atlante del cervello di ratto di Paxinos & Watson del 2007
Lama chirurgica	Swann-Morton Ltd.	206	Per incidere l'area di pelle che si sovrappone alla corteccia visiva primaria per impiantare gli elettrodi VEP
sutura	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd		Sutura intrecciata in seta 3-0 non assorbibile, per la retrazione cutanea durante l'intervento di impianto di elettrodi VEP
Unguento per gli occhi alla tobramicina 0,3%	Laboratori Alcon	CAS 32986-56-4	Nome proprietario: Tobrex. Unguento antibiotico profilattico applicato intorno alla ferita cutanea dopo l'intervento chirurgico
Tropicamide 0,5%	Laboratori Alcon	CAS 1508-75-4	Nome proprietario: 0,5% Mydriacyl collirio, instillato per ottenere la midriasi per la registrazione ERG
Xilazina	Laboratori Troy	Ilio xilazil-100	Anestetico di grado farmaceutico per la registrazione elettrofisiologica
Puntale per pipetta	Eppendorf Pty Ltd	Codice 0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL, per elettrodi su misura
Lethabarb Iniezione di eutanazia	Virbac (Australia) Pty Ltd	LETHA450	325 mg/mL di pentobarbital sodico per l'eutanasia rapida
Microsoft Office Excel	Valentina	versione 2010	Software per fogli di calcolo per l'analisi dei dati