Contrazione Arteria mesenterica e Studi Relax Utilizzando Myography automatica Wire

Sommario

Un metodo myography automatizzato per misure di forza in arterie mesenteriche isolato è descritto. Si avvale di un Mulvany-Halpern miografo filo doppio Auto 510A per determinare le risposte a fenilefrina e calcio extracellulare. Il metodo permette la determinazione costante di risposte isometrica per agonisti in piccoli vasi di diametro di 60-300 micron, in modo indipendente.

Abstract

Vasi di resistenza prossimale, come le arterie mesenteriche, contribuiscono in modo sostanziale alla resistenza periferica. Questi piccoli vasi compreso tra 100-400 micron di diametro principalmente in funzione dirigere il flusso del sangue ai vari organi a seconda delle esigenze generali del corpo. L'arteria mesenterica ratto ha un diametro maggiore di 100 micron. La tecnica myography, inizialmente descritto da Mulvay e Halpern ^1, si è basata sul metodo proposto da Bevan e Osher ^2. La tecnica fornisce informazioni su piccole imbarcazioni in condizioni isometriche, dove è impedito riduzione sostanziale della preparazione muscolare. Dal momento che la produzione di forza e la sensibilità dei vasi di diversi agonisti dipende il grado di allungare, in base alle attivo tensione-lunghezza relazione, è essenziale per condurre studi in condizioni di contrazione isometrica per evitare che la conformità dei fili di montaggio. Fili di acciaio inossidabile sono preferibili ai fili di tungsteno a causa dell'ossidazione di quest'ultima, che colpisce le risposte registrate ^3. La tecnica consente il raffronto di agonista-indotto le contrazioni dei vasi montati per ottenere elementi per la normale funzione dei recettori della muscolatura liscia vascolare delle cellule.

Abbiamo dimostrato in diversi studi che isolate le arterie mesenteriche che sono contratte con phenylyephrine rilassarsi dopo l'aggiunta delle concentrazioni cumulative di calcio extracellulare (Ca ^{2 +} _e). I risultati ci hanno portato a concludere che i nervi sensoriali perivascolare, che esprimono il G protein-coupled Ca ^{2 +} recettore sensibile (CaR), mediare questa risposta vasodilatazione. Utilizzando un metodo automatizzato myography filo, mostriamo qui che le arterie mesenteriche da Wistar, Dahl sensibili al sale (DS) e Dahl resistenti al sale (DR) ratti rispondono in modo diverso a Ca ^{2 +} _e. I tessuti di ratti Wistar hanno mostrato maggiore Ca ^{2 +-sensibilità} rispetto a quelli di DR e DS. Espressione CaR ridotto nelle arterie mesenteriche da ratti DS correla con ridotta Ca ^{2 +} _e-indotta di rilassamento isolato, pre-contratto arterie. I dati suggeriscono che l'auto è richiesto per il rilassamento delle arterie mesenteriche sotto tono adrenergico aumentato, come avviene nella ipertensione, e indicano un difetto nella via di segnalazione CaR negli animali Dahl, che è molto più grave nei DS.

Il metodo è utile per determinare la reattività vascolare ex vivo nelle arterie di resistenza mesenteriche e simili piccoli vasi sanguigni e confronti tra agonisti e / o antagonisti possono essere facilmente e costantemente valutati fianco a fianco ^6,7,8.

Protocollo

1. Isolamento di arteria mesenterica piccolo ratto

1. Anestetizzare animali con isoflurano in una camera chiusa e pulire l'addome con l'alcol.
2. Eseguire una linea mediana laparotomia per esporre letto mesenterica.
3. Utilizzando le forbici, rimuovere circa 85 cm di intestino con l'alimentazione vasi con l'arteria mesenterica superiore. Tagliare l'estremità prossimale della sezione intestinale vicino al piloro e la fine distale vicino alla giunzione ileo-coecal. Segmenti dell'intestino sono isolati da topi che sono profondamente anestetizzati con isoflurano e eutanasia da open-torace puntura cardiaca.
4. Situato sezione asportato in un piatto rivestito di Petri contenente PSS ed eseguire la dissezione dell'arteria mesenterica a temperatura ambiente.
5. Fissare l'estremità prossimale dell'intestino sul lato destro e pin out il resto del senso antiorario intestineina (fine ieproximal sul sistema vascolare alimentazione sinistra dall'altra parte dell'intestino).
6. Sezionare il ramo II e III segmenti insieme con un pezzo del segmento prossimale.
7. Sezionare la vena e isolare l'arteria (con a forma di V punto di diramazione) e pulirlo, rimuovendo il tessuto connettivo e adiposo. Evitare il contatto diretto con l'arteria tirando delicatamente con una pinza e taglio attraverso la membrana del tessuto connettivo.

2. Montaggio della nave

1. Tagliate due segmenti brevi (≈ 4 cm) di 40 micron di tungsteno senza filo di acciaio inossidabile e, con una pinza sottile, inserire uno nel lume di ogni arteria facendo attenzione a non danneggiare l'endotelio. Utilizzare la punta del filo per aprire il lume, se necessario. Grondante di sangue fuori dal vaso è un buon segno il lume è aperto.
2. Riempire la camera miografo con soluzione salina fisiologica (PSS; mM: 115 NaCl, 4.7 KCl, 1,4 MgSO ₄ 0,7 H ₂ O, 5 NaHCO _3, 1,2 K ₂ HPO _4, 1,1 Na ₂ HPO _4, 1,0 CaCl _2, 20 e HEPES 5 glucosio, pH 7,4) con l'acido ascorbico (100 mM) a 37 ° C e con pinze trasferire accuratamente l'segmento filettato nave dalla capsula di Petri nella camera a temperatura ambiente e trasferire il segmento asportato nave prossimale alla camera miografo e tirare la finale lungo il cavo di alimentazione in vaso. Evitare allungamento della nave.
3. Fissare la fine vicina del filo in senso antiorario con la vite di fissaggio vicino sulla destra mascella collegato al micrometro. Prendere l'estremità libera del filo con una pinza e sicuro in senso orario sotto la vite di fissaggio molto sulla destra della mandibola. Assicurarsi che il segmento nave lungo il filo si trova nello spazio tra le fauci senza alcun contatto con la stessa mascella.
4. Avvitare le mascelle a parte, e allineare la seconda parallela filo con la nave e inserirlo nel fondo del lume. Delicatamente il filo di alimentazione attraverso il lume del segmento di vaso in un unico movimento con il filo già montato come una guida. Tenere il filo di circa 1 cm dalla nave per evitare che si estende durante la manovra, ed evitare di toccare l'endotelio.
5. Avvitare le mascelle insieme e garantire che si muove secondo filo di montaggio sotto il primo fissato sulla destra della mandibola.
6. Fissare la fine vicina del secondo filo in senso orario, sotto la vite di fissaggio vicino di sinistra mascella collegato al trasduttore.
7. Fissare l'estremità del filo sotto la vite di fissaggio sulla mascella a sinistra e stringere per allungare il filo.
8. Una volta che il montaggio è completo, ripristinare il motore nel "Menù di montaggio" e avviare la normalizzazione della nave.

3. Normalizzazione

Il Dual miografo Wire Auto System-510A ha una funzione automatica di normalizzazione, che è valutato dal menu "normalizzazione" e permette alla barca di essere allungato per una circonferenza normalizzato interno da una procedura standardizzata secondo il protocollo del produttore dopo equilibrazione per 30 minuti a 37 ° C. Una curva esponenziale è poi sistemare i dati di pressione interna circonferenza. La procedura definisce il diametro del lume (d 100) che l'arteria avrebbe avuto in vivo quando rilassato e sotto una pressione transmurale di 100 mmHg ¹ La normalizzazione dei parametri per l'arteria mesenterica topo sono come segue.

1. Pressione transmurale obiettivo = 13,3 kPa (100 mm Hg).
2. Tempo = 60 sec; Durata di ciascuna delle fasi normalizzazione.
3. IC ₁ / IC ₁₀₀ = 0.9 (IC ₁ = circonferenza interna normalizzato, IC ₁₀₀ = circonferenza interna corrispondente alla pressione di destinazione.
4. Calibrazione oculare 2 * Δ (mm / oculare divisione), 2 delta è per ragioni di programmazione.

Misurare la lunghezza dell'arteria mesenterica montata usando l'oculare letture microscopio quando i filetti sono oltre le estremità vicine e lontane del segm nave montataent. In breve, la lunghezza del segmento di vaso montato è misurata al massimo ingrandimento di un oculare calibrato oculare del microscopio dissezione. L'oculare di lettura con i capelli-line sul fondo del segmento (a ₁₎ e la fine vicina del segmento (a ₂₎ nelle divisioni oculari sono misurati e registrati. Questi valori, con le letture micrometro, prima e dopo l'allungamento della nave vengono registrati e inseriti nel menu del programma per calcolare la curva arredata e il diametro interno corrispondente alla pressione transmurale obiettivo di 100 mm Hg

Nei nostri studi, le arterie sono stati fissati per il diametro del lume di d ₁ = 0,9 xd _100, dove lo sviluppo forza attiva è massima. Sviluppo della forza attiva di ≥ 10 mN nelle arterie mesenteriche ratto è considerato ottimale per gli esperimenti di procedere. Tessuti con minore forza attiva sono stati scartati.

4. Misurazione di risposte

Dopo la normalizzazione, le proprietà meccaniche e funzionali dei vasi sono riattivate eseguendo un "avvio standard", che coinvolge vasi impegnativo con ripetute applicazioni (in genere 2 o 3) su 5 fenilefrina mM (PE) per ottenere contrazioni riproducibile. Un tipico "start standard" nel nostro laboratorio è costituito da una serie di stimoli e di periodi di washout come segue:

1. Sostituire camera miografo coperchio e iniziare aerazione con il 95% di aria e il 5% di CO _2.
2. Riempire da camera con PSS fresca (contenente 100 mM acido ascorbico)
3. Nave contratto con mM PE 5 per 5 minuti e lavare 4 volte con tampone PSS.
4. Dopo l'ultimo lavaggio, camera ricarica con PSS ed attendere 3 minuti prima di ripetere passi (ii) e (iii).

Dopo l'avvio standard, l'arteria è pronto per l'esperimento. Rilassamento dei vasi contratto sono valutati da oltre cumulativo di concentrazioni crescenti di CaCl ₂ (0,5 - 4 mm). Navi quando inibitori sono utilizzati sono pre-incubate con i composti nella camera miografo per 20 minuti e presente durante il test.

5. Analisi dei dati

La "normalizzazione" dei dati per le navi e tracciati forza, direttamente convertiti in dati di testo, sono stati analizzati con il 11,0 SigmaPlot grafico del programma (SYSTAT Software, Point Richmond, CA) e tracciati, come mostrato nella Figura 1. Dati concentrazione-risposta, calcolato dal tracciato, sono state analizzate determinando CE ₅₀ valori da dati sperimentali montato su un quattro parametro della funzione logistica nel menu di Farmacologia del programma. I confronti tra i gruppi e all'interno dei gruppi sono stati eseguiti da una analisi della varianza (ANOVA) e le differenze con p 0.05

6. Rappresentante dei risultati:

Parametri	Wistar	Dahl sensibili al sale	Dahl resistenti al sale
L 100 (micron)	83,26 ± 2,33	91,52 ± 4,67	117,45 ± 8,43 *
X 1	604,21 ± 41,97	752,24 ± 85,25	745,84 ± 110,09
r 2	0,99 ± 0,003	0,97 ± 0,008	0,97 ± 0,007

* La differenza tra i valori di L _{100 del} Wistar e DR sono statisticamente significative. Shapiro-Wilk Test di normalità passato (p = 0,588); test varianza pari passato (p = 0,237).

L ₁₀₀ = diametro interno del segmento montato corrispondente alla pressione transmurale bersaglio.

X ₁ = L'impostazione posizionatore micro necessari per allungare la nave montati al suo interno circonferenza normalizzato (ovvero il valore della lettura micrometro al quale sono stati eseguiti esperimenti).

r ² = coefficiente di regressione per eccesso di (X _i, Y _i) una curva esponenziale.

NB: La procedura dettagliata è descritta nel manuale per il sistema 510A miografo ^6.

Tabella 1. Esempio di lettura dei parametri di normalizzazione per i segmenti di arteria mesenterica da Wistar, DS e DR da programma base indicato nel "Menù normalizzazione". I valori sono medie (± SEM) di 5 animali. * Le differenze tra i valori di L _{100 del} Wistar e DS sono statisticamente significativi (p <0,05).

Wistar	DS	DR
14,2 ± 0,6		20,9 ± 1,3 *

Tabella 2. Tensioni sviluppati (MN), in arterie mesenteriche isolato dal Wistar, DS e ratti DR, in seguito alle domande su 5 mM PE per ogni nave. Valori riportati sono mezzi (± SEM) di 6-8 animali. * Significativamente diversi dai controlli Wistar (p <0,05).

Figura 1. Ca ^{2 +} _e-indotta relax di un PE-contratto dell'arteria mesenterica da un ratto Wistar montato in una miografo filo in soluzione salina fisiologica contenente 1 mM Ca ^{2 +.} L'arteria è stata equilibrata per 30 minuti a 37 ° C con aerazione costante e risposte a Ca ^{2 +} _e determinato. Una forza rappresentativa tracciamento con l'aggiunta di 5 micron PE seguita da aggiunte cumulativo di Ca ^{2 +} è mostrato.

Figura 2. Ca ^{2 +} _e-indotta relax di un PE-contratto dell'arteria mesenterica da un topo DS montato in una miografo filo in soluzione salina fisiologica contenente 1 mM Ca ^{2 +.} L'arteria è stata equilibrata per 30 minuti a 37 ° C con aerazione costante e risposte a Ca ^{2 +} _e determinato. Una forza rappresentativa tracciamento con l'aggiunta di 5 micron PE seguita da aggiunte cumulativo di Ca ^{2 +} è mostrato. Ca ^{2 +} il relax è stata gravemente compromessa in questo tessuto rispetto a quelli di ratti Wistar e DR.

Figura 3. Ca ^{2 +} _e-indotta relax di un PE-contratto dell'arteria mesenterica da un topo DR montato in una miografo filo in soluzione salina fisiologica contenente 1 mM Ca ^{2 +.} L'arteria è stata equilibrata per 30 minuti a 37 ° C con aerazione costante e risposte a Ca ^{2 +} _e determined.A forza di riferimento analisi su aggiunta di 5 mM PE seguita da aggiunte cumulativo di Ca ^{2 +} è mostrato.

Figura 4. A. [Ca ^{2 +]} _{e curve} di risposta. Grafico a barre che mostra B. CE ₅₀ valori per il relax determinata inserendo i dati di un'espressione quattro curve.C.CaR parametri logistici nelle sale giochi mesenterica isolati da topi DR e DS.

Discussione

L'ipertensione è una delle principali cause di morbilità cardiovascolare, cerebrale e renale / mortalità. L'incidenza di ipertensione è alta nella popolazione e sensibili al sale ipertensione è particolarmente elevato nella popolazione, e più frequente nei neri rispetto ai bianchi. Questo si ritiene sia dovuta alla tendenza dei neri a trattenere sodio nei reni ^9. Sale-sensibilità è un fattore importante che contribuisce alla malattia renale ed è associata a disfunzione endoteliale, ma il meccanismo no...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome di attrezzature / reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Miografo Wire auto sistema Dual-510A DMT-USA, Inc.	Atlanta, GA.	100151
PowerLab/4SP sistema di acquisizione dati	ADInstruments, Colorado Springs, CO	ML750	Nuovi modelli con 4-16 canali di ingresso sono disponibili.
Dell Dimension XPS Gen 4 Computer	Conca
STEMI SV II (Apo) Microscopio Dissection con oculare	Carl Zeiss internazionale.
Wistar, Dahl sensibili al sale, Dahl resistenti al sale ratti	Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN.
Roditori chow	Harland Tekland, Madison, WI.
Fenilefrina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
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