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1. Impostazione dell'apparecchio per pipette a sbuffo
NOTA: Ci sono cinque componenti di base in questa configurazione: la pipetta di vetro, il tubo, la siringa, il micromanipolatore e il tampone (di Hank) Tabella 1. In questa configurazione potrebbe essere utilizzato qualsiasi tampone con concentrazioni di sale fisiologicamente rilevanti.
- Estrarre una pipetta in borosilicato per avere un puntale di apertura di circa 45 μm di diametro utilizzando un estrattore per micropipette e le specifiche nella Tabella 2.
NOTA: In condizioni sperimentali, è stato riscontrato che 45 μm è una dimensione adatta al diametro dell'apertura della pipetta. Lievi variazioni nella dimensione dell'apertura non dovrebbero influire in modo significativo sui risultati. È importante notare che deviazioni maggiori da questo numero dovrebbero comunque funzionare per l'induzione delle varici regolando l'altezza della siringa collegata alla pipetta tramite un tubo, ma ciò richiederà una ricalibrazione del valore di pressione.
- Inserire l'estremità non estratta della pipetta in un sottile tubo di gomma.
nota: La parete del tubo deve essere sottile e rigida per ridurre al minimo la resistenza del fluido, assicurando che l'altezza della siringa sia direttamente proporzionale alla pressione del fluido che scorre attraverso la pipetta con resistenza trascurabile. Il tubo non deve essere più lungo di circa 0,6 m di lunghezza per ridurre ulteriormente la resistenza.
- Collegare l'altra estremità del tubo a una siringa di plastica da 10 ml attraverso un connettore con valvola girevole.
nota: La siringa di plastica deve essere tenuta a un'altezza costante e misurabile per garantire una misurazione accurata della pressione presunta che fluisce dalla pipetta. È stata utilizzata un'altezza di 190 mm poiché fornisce una pressione minima ma induce in modo affidabile le varicosità negli assoni. Altri valori di altezza possono essere utilizzati anche se la pressione provoca il distacco delle cellule dalla superficie del vetrino coprioggetti. Si consiglia di utilizzare la stessa impostazione per tutta la durata dell'esperimento.
- Inserire la pipetta nella parte superiore della vite del micromanipolatore per tenerla in posizione. Avvitare la vite metallica con la punta piatta fissata al braccio del micromanipolatore in modo che tenga l'estremità non tirata della pipetta appena sopra il punto in cui è fissato il tubo di gomma. Inclinare la pipetta di 45° rispetto alla superficie dei vetrini coprioggetti contenenti neuroni. NOTA: Il micromanipolatore deve essere costruito in modo che la pipetta possa essere tenuta senza restringere il tubo di gomma. Il micromanipolatore deve consentire il movimento della pipetta nelle direzioni x, y e z per posizionarla con precisione all'interno dell'intervallo delle cellule. Di seguito sono riportati un grafico e una fotografia dell'apparecchio (Figura 1).
- Accendi un filtro a fluorescenza, apri l'apertura e assicurati che si possa vedere un punto fluorescente che passa attraverso l'obiettivo. Utilizzando il micromanipolatore, spostare la pipetta in una posizione che allinei la punta con il punto fluorescente e abbassare la pipetta in una posizione appena sopra l'altezza della capsula di coltura cellulare (35 mm x 10 mm). Una volta in posizione, accendere la luce trasmessa e disattivare la fluorescenza.
- Usando una pinzetta, aggiungere un vetrino coprioggetti (con le cellule rivolte verso l'alto verso la pipetta) dalla piastra di coltura cellulare alla piastra di coltura cellulare contenente circa 2 ml di tampone di Hank a temperatura ambiente.
- Posizionare il piatto di coltura contenente il vetrino coprioggetti sul cannocchiale.
- Utilizzando la manopola di messa a fuoco fine e l'obiettivo 20X, mettere a fuoco su un piano di circa quattro giri completi sopra le celle (circa 0,4 mm). Utilizzare il micromanipolatore per posizionare la punta della pipetta in modo che sia focalizzata e al centro, sul lato sinistro del piano, come visto attraverso gli oculari.
nota: I dendriti sono proiezioni che dovrebbero trovarsi nella stessa cornice del corpo cellulare da cui hanno origine. Per indurre le varici assonali, si dovrebbero seguire proiezioni più lunghe dal corpo cellulare agli assoni mediali e distali.
2. Calibrazione della pressione della pipetta utilizzando un sistema a membrana estensibile
- Configurare l'apparecchio per pipette a soffiante con gli stessi parametri descritti sopra su un sistema contenente una membrana in silicone microfabbricata (500 μm di diametro e 50 μm di spessore) e focalizzare il microscopio sulla superficie della membrana.
nota: Questo sistema è stato progettato per misurare piccoli valori di pressione e una spiegazione del sistema è stata pubblicata in precedenza. Questa misurazione deve essere eseguita una sola volta per gli esperimenti di sbuffo se viene utilizzata la stessa identica impostazione di sbuffo.
- Focalizzare il microscopio sulle schiere di micropunti (4 μm di diametro e 10 μm di distanza, misurati tra i centri). Ruotare la valvola di arresto e far defluire il fluido dalla pipetta. Esaminare la deflessione della membrana in risposta alla pressione del fluido con un microscopio confocale.
- Utilizza un modello lineare per determinare la pressione corrispondente associata alla deflessione della membrana.
nota: Mentre uno studio recente ha rilevato che una deflessione di w= -3,143 ± 0,69 μm è stata ottenuta per un'altezza della siringa di 190 mm, ciò ha prodotto una pressione di 0,25 ± 0,06 nN/μm2 dall'attuale configurazione della pipetta, che rientra nell'intervallo fisiologico e patologico, sebbene l'altezza della siringa non sia l'unico determinante. Anche altri fattori influenzano l'esatto valore della pressione sui neuroni, tra cui l'apertura della pipetta, il posizionamento (distanza e angolo) della punta della pipetta rispetto alle cellule e persino la flessibilità del tubo.
3. Sbuffare per Indurre Varici
- Una volta che la pipetta è in posizione, mettere a fuoco il microscopio su un piano che contenga una regione di interesse. Posizionare le cellule e i processi nella metà sinistra del campo di imaging (visto dall'acquisizione dal vivo della fotocamera) all'interno dell'area di sbuffo, mentre la metà destra si trova al di fuori dell'area di sbuffo.
nota: A causa dell'estesa crescita di assoni e dendriti dei neuroni, è improbabile che tutti i processi di un neurone si trovino all'interno della stessa area di sbuffo. Questo è in realtà uno dei vantaggi di questo sistema, che consente di esaminare l'effetto locale del soffio. Esistono due tipi di sbuffo che possono essere utilizzati per indurre varici: sbuffo di lunga durata e sbuffo a impulsi.
- Sbuffando
- Sbuffo di lunga durata
- Posizionare la siringa all'altezza, 190 mm sopra il vetrino coprioggetti contenente i neuroni in coltura. Inizia l'imaging time-lapse dell'area di interesse con un tempo di esposizione ottimizzato che rivela una chiara morfologia neuronale. Acquisire almeno 15 fotogrammi a intervalli di 2 s (30 s totali) come linea di base. L'intervallo può essere regolato in base all'esperimento. Al fotogramma 16, aprire la valvola di arresto girevole della siringa e lasciare che il fluido fluisca per 75 fotogrammi (150 s). Al fotogramma 75, chiudere la valvola in modo che il flusso del fluido si interrompa. Interrompi l'acquisizione video.
NOTA: Questo dovrebbe indurre varicosità assonali nei neuroni 7-9 DIV entro 5-10 s, mentre i neuroni più vecchi impiegano più tempo a formare varici.
- Impulso (durata 2 s) sbuffo
- Posizionare la siringa all'altezza corretta (190 mm). Avviare l'imaging time-lapse e acquisire almeno 15 fotogrammi (30 s) a intervalli di 2 s. Al fotogramma 16, aprire la valvola della siringa e far fluire il fluido, quindi chiudere la valvola dopo 2 s. Attendere 5-20 s (a seconda della frequenza da testare) prima di riaprire la valvola. Ripetere l'apertura e la chiusura della valvola per creare impulsi di fluido e continuare per un periodo totale di 150-300 s. Continuare l'imaging time-lapse per 20 minuti per acquisire la fase di recupero.
nota: Quando l'intervallo è più lungo di 10 s, gli impulsi inducono drasticamente meno varicosità. A un intervallo di 20 s, nessuna varicosità può essere indotta dagli impulsi. Per ottenere una formazione di varici affidabile e costante, si consiglia che l'altezza della siringa sia di circa 190 mm. L'altezza della siringa e la pressione del fluido non devono essere aumentate fino al punto in cui le cellule iniziano a staccarsi dalla superficie del vetrino.
- Prima di un giorno di utilizzo, pulire la configurazione (pipetta, tubo e siringa) facendo scorrere circa 10 ml di etanolo al 70% attraverso la configurazione. Dopo il lavaggio con etanolo, far scorrere 10 ml di tampone di Hank (o tampone desiderato) attraverso la configurazione per preparare il sistema per l'uso di quel giorno. Dopo aver terminato gli esperimenti della giornata, pulire l'impianto come descritto in precedenza con etanolo per prevenire la crescita di contaminanti durante la notte.
Tabella 1: La ricetta del buffer di Hank. Questa ricetta prepara il tampone utilizzato nel protocollo di soffiatura e durante l'imaging di cellule vive.
| Il tampone di Hank (filtro, pH = 7.4, conservare a 4 °C |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | Kcl |
| 1,2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glucosio |
| 20 mM | HEPES |
Tabella 2: Parametri di estrazione delle pipette. Fornisce i parametri da impostare sull'estrattore per pipette per ottenere un'apertura che si aggiri intorno ai 45 μm di diametro.
| Parametri di estrazione delle pipette |
| calore | tirare | velocità | ritardo | pressione | rampa |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
